弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶相互作用的鉴定

郑 斌，尹志奎，詹希美

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性的细胞内寄生原虫，在宿主细胞内繁殖以及破坏宿主细胞，引起致病。弓形虫的入侵机制目前尚未阐明，微线体蛋白（microneme protein，MIC）、菱形体蛋白（rhomboid，ROM）和肌动蛋白（actin）等都参与了弓形虫主动入侵宿主细胞的过程［1－3］。若能利用蛋白相互作用技术，以已知入侵蛋白来探寻一些未知的作用蛋白，则有助于揭示弓形虫的入侵机制。我们在前期的研究中采用GST pull－down技术已筛选到 MIC6羧基端（MIC6C）的作用蛋白［4］，本文利用免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）技术对前期研究的初筛结果进行鉴定，并提供细胞定位上的依据。

1 材料与方法

1．1 弓形虫株和主要仪器 弓形虫RH株为中山大学中山医学院寄生虫学教研室传代保种；Olympus研究型生物荧光显微镜（BX51，日本）；SPOT彩色面阵CCD（分辨率为1 600×1 200pixel，美国）；图像采集卡（CCD附件，美国）。

1．2 主要试剂 硝酸纤维素膜（NC）购自美国PALL公司；免疫共沉淀用 protein G／protein A sepharose购自美国Calbiochem公司；兔免疫前血清、兔源性 GST－MIC6C多克隆抗体（效价1∶8 000）、鼠源性 GST－MIC6C多克隆抗体（效价1∶4 000）、鼠源性醛缩酶－His6多克隆抗体（效价1∶4 000）、鼠源性 Actin－His6多克隆抗体（效价1∶4 000）和兔源性GST－MIC2C多克隆抗体（效价1∶8 000）为本实验室前期制备；免疫印迹增强化学发光法（ECM）试剂盒（大鼠IgG）购自美国Promega公司；X感光胶片为Kodak产品；显影液、定影液、兔抗大鼠IgG－HRP和荧光二抗（羊抗兔IgGTRITC、兔抗大鼠IgG－FITC）购自武汉博士德公司。

1．3 免疫共沉淀实验（immunoprecipitation，IP）制备弓形虫速殖子裂解液［4］。分别取100μL免疫共沉淀用protein G plus／protein A sepharose于2支1．5mL Eppendorf管中，分别加入100μL兔源性GST－MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清，4℃缓慢旋转结合1h。离心，4 000r／min×4min，弃上清，PBS重悬。PBS洗2次，最后1次用Buffer A（50mmol／L KCl，10mmol／L HEPES，pH 7．7，1 mmol／L MgCl2，1mmol／L EDTA，2mmol／L ATP，0．2%Tween－20）洗涤。分别加入600μL弓形虫速殖子裂解液，4℃缓慢旋转结合12h。离心，4 000r／min×4min，弃上清，Buffer A洗涤5次。4×SDS凝胶加样缓冲液重悬sepharose，100℃加热5min，SDS－PAGE，转 NC 膜，分别用大鼠源性GST－MIC6C多克隆抗体、醛缩酶－His6多克隆抗体和Actin－His6多克隆抗体为一抗。兔抗大鼠IgGHRP为二抗温育NC膜，常规漂洗后，免疫印迹增强化学发光法（ECM）检测NC膜。

1．4 间接免疫荧光定位

1．4．1 MIC6蛋白和醛缩酶蛋白在弓形虫体内的定位 新鲜收集的弓形虫速殖子，PBS洗3次，涂片，室温下晾干。3．7%多聚甲醛（多聚甲醛3．7g，加蒸馏水50mL，加热至60℃，搅拌并加入1mol／L NaOH数滴，直至溶液变清，冷却后用0．1mol／L pH 7．4PBS加至100mL）固定，室温20min。PBS－Ca2＋液（CaCl21．11g，PBS 100mL）洗5次，室温下封闭液（5%BSA，0．25%Triton－100）封闭1h。PBS洗5次。滴加一抗液（兔源性GST－MIC6C多克隆抗体、鼠源性醛缩酶－His6多克隆抗体），37℃湿盒温育1h。PBS洗5次。滴加荧光二抗（羊抗兔IgG－TRITC），37℃湿盒温育1h。PBS洗5次。滴加荧光二抗（兔抗大鼠IgG－FITC），37℃湿盒温育1 h。PBS洗5次，室温下晾干。荧光显微镜油镜下观察并拍照。

1．4．2 MIC2蛋白（阳性对照蛋白）和醛缩酶蛋白在弓形虫体内的定位 一抗液为兔源性GSTMIC2C多克隆抗体和鼠源性醛缩酶－His6多克隆抗体，余同方法1．4．1。

2 结 果

2．1 免疫共沉淀实验鉴定MIC6C的作用蛋白免疫共沉淀产物SDS－PAGE后，转NC膜，分别用大鼠源性GST－MIC6C多克隆抗体、醛缩酶－His6多克隆抗体和Actin－His6多克隆抗体为一抗。兔抗大鼠IgG－HRP为二抗温育NC膜，常规漂洗后，ECM检测NC膜。在GST－MIC6C多克隆抗体的IP产物中，有3个蛋白条带可分别被大鼠源性GSTMIC6C多克隆抗体、醛缩酶－His6多克隆抗体（antialdolase）和 Actin－His6多克隆抗体（anti－actin）识别，而在免疫前血清的IP产物中未检测到蛋白条带（图1）。

图1 免疫共沉淀实验产物的Western blot分析Fig．1 Western blot analysis of products from immunoprecipitation1：T．gondii lysate；2：The IP experiment products of anti－GST－MIC6C；3：The IP experiment products of preimmune serum

2．2 MIC6蛋白和醛缩酶蛋白在弓形虫体内的间接荧光定位 新鲜弓形虫速殖子涂片，多聚甲醛固定，封闭液封闭。一抗液（兔源性GST－MIC6C多克隆抗体、鼠源性醛缩酶－His6多克隆抗体）常规温育、漂洗，先滴加羊抗兔IgG－TRITC荧光二抗，温育、漂洗，再滴加兔抗大鼠IgG－FITC荧光二抗，温育、漂洗，室温下晾干。荧光显微镜下观察。首先在自然光源下观察玻片上虫体，拍照。更换到荧光光源，FITC在495nm激化，525nm发射荧光，呈绿色荧光。拍照。TRITC最大吸收光谱550nm，发射光谱600～620nm，呈现橙红色荧光。SPOT 4．0．2和Photoshop 8．0分析图像。在虫体的顶端可观察到红色荧光（MIC6蛋白）和绿色荧光（醛缩酶蛋白）（图2）。

2．3 MIC2蛋白（阳性对照蛋白）和醛缩酶蛋白在弓形虫体内的间接荧光定位 一抗液采用兔源性GST－MIC2C多克隆抗体、大鼠源性醛缩酶－His6多克隆抗体，荧光二抗同上，荧光显微镜下观察并拍照。SPOT 4．0．2和 Photoshop 8．0分析图像。在虫体的顶端可观察到红色荧光（MIC2蛋白）和绿色荧光（醛缩酶蛋白）（图3）。

图2 MIC6蛋白和醛缩酶蛋白在弓形虫顶端的定位Fig．2 MIC6and aldolase are apically localized in T．gondii MIC6was localized using rabbit anti－MIC6Cand goat anti－rabbit conjugated to TRITC （red）；aldolase was visualized using rat anti－aldolase and rabbit anti－rat conjugated to FITC （green）

图3 MIC2蛋白和醛缩酶蛋白在弓形虫顶端的定位Fig．3 MIC2and aldolase are apically localized in T．gondii MIC2was localized using rabbit anti－MIC2Cand goat anti－rabbit conjugated to TRITC （red）；aldolase was visualized using rat anti－aldolase and rabbit anti－rat conjugated to FITC （green）

3 讨 论

弓形虫的 MIC6和 MIC1、MIC4组成 MIC6－MIC1－MIC4复合体参与虫体的入侵过程。MIC1具有凝集素特性，在识别、粘附宿主细胞中发挥重要作用［5］；MIC4有6个富含半胱氨酸的苹果模序（apple motif）结构，其第5个苹果模序具有潜在的半乳糖粘合特性，很可能干预宿主的免疫保护过程［6］。MIC6的氨基端（N端）通过 MIC1连接 MIC4，MIC6的跨膜区将 MIC6－MIC1－MIC4复合体固定于膜上，经初步筛选，MIC6的羧基端（MIC6C）与醛缩酶作用参与虫体入侵［4］。该作用蛋白为GST pull－down技术筛选获得，为排除 GST pull－down技术有时会因蛋白质的电荷、第三者的中介等产生假阳性结果，有必要采用其它的蛋白作用技术来鉴定MIC6C的作用蛋白。

免疫共沉淀实验的结果表明在自然状态下与MIC6C端作用的蛋白是醛缩酶，即无论在虫体内（免疫共沉淀的结果）或虫体外（GST pull－down的结果），MIC6C与醛缩酶都存在相互作用；此结果也与Jewett等的结论相符［7］。MIC6和醛缩酶的间接免疫荧光定位显示两蛋白共定位于虫体的顶端，为MIC6和醛缩酶相互作用的确立提供了细胞定位学上的证据。至于MIC6和醛缩酶的作用位点如何则有待于进一步的研究。

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