力竭运动对大鼠心脏传导系统电压门控钠离子通道α亚基的影响

常芸 杨红霞 薄冰

国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

运动性心脏损伤与心律失常一直是体育科学领域关注的医学问题，部分运动性心律失常的发生与长期反复大强度运动对心脏的病理性损伤有关，往往影响运动员身体健康、系统训练以及比赛成绩［1-4］，尤其耐力运动员和从事过大强度与大运动量训练的运动员和教练员，心房纤颤（房颤）与心房扑动的发生率明显高于其他项目运动员［5-7］，严重者甚至发生运动性猝死［1］，引起广泛关注。国内外研究证实，运动员心律失常发生率高于常人，且专项训练时间长的运动员更常见［8-14］，因此而退赛或退役的运动员屡见不鲜，一些运动员和运动爱好者不得不停止运动接受治疗。运动性心律失常发生机制极其复杂，涉及因素众多，目前运动性心律失常发生的可能原因仍未完全阐明，以往实验研究大多数集中于心肌组织，较难真实概括心律失常发生的病理机制。心脏传导系统作为心电活动的控制中心和冲动传导的重要部位，其特殊的组织结构和细胞类型决定其具有不同于普通心肌的心电起搏和传导功能的关系，与各种类型心律失常的发生和发展密切有关，尤其离子通道与心电起搏、传导与运动性心律失常的关系引起我们的关注与研究兴趣。

电压门控心脏钠离子通道由一个α亚单位和一个调节β亚单位组成。由SCN5A基因编码的电压门控钠离子通道α亚基控制心脏钠离子通道产生内向性钠电流（INa），形成心脏动作电位的快速上升支，在心肌细胞的收缩-兴奋耦联中起重要作用［15］。最近研究显示，SCN5A的H558R多态位点可增加孤立性心房颤动的易感性［16］，还发现携带N1986K多态位点可致心房颤动［17］。为了进一步探讨运动性心律失常的发生机制，本研究制备了运动性心肌损伤实验动物模型，观察力竭运动后心脏传导系统SCN5A表达的变化，试图为阐明运动性心律失常发生机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

健康雄性成年SD大鼠100只，8周龄，体重（22.0±8）g，购自北京维通利华实验动物中心，动物生产许可证SCXK（京）2011-0001。在国家体育总局科研所SPF动物实验室以标准啮齿动物饲料喂养，动物使用许可证SYXK（京）2011-0030，自由饮食。饲养环境为室温（20±2）℃，光照时间12小时，相对湿度40%～55%。

1.2 运动负荷

将100只实验大鼠随机分为10组，每组10只。其中一次力竭和2周反复力竭游泳运动各4组（最后一次力竭运动后即刻、4小时、12小时、24小时），相应安静对照2组。安静对照组不运动，力竭运动各组大鼠尾部负重为3%体重，2周反复力竭游泳运动组每周运动6天，每天1次。力竭标准参照Thomas报道［18］，经过10 s动物仍不能返回水面，并且捞出后置于平面不能完成翻正反射。

1.3 实时荧光定量PPCCRR检测

分别于最后一次力竭运动后即刻、4小时、12小时及24小时不同时相取材，迅速取出心脏，光镜定位心脏传导系统，运用激光显微切割仪切割分别收集的窦房结细胞或细胞团，采用Trizol法提取总RNA，并逆转录cDNA，存于-20℃备用。通过互联网搜索Genbank查找目标因子结蛋白和内参照β-actin的引物基因序列，应用Primer 5软件进行引物设计，引物扩增目标基因片断长度均小于150 bp，其PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测验证引物可用后，再进行荧光定量PCR，取定量PCR用96孔板，加入cDNA和引物配置25 μl反应体系。实时定量RT-PCR主要过程：预变性95℃30 s，PCR反应95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。检测CT值。设计的引物由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 PCR引物序列

1.4 免疫荧光检测

分别于最后一次力竭运动后即刻、4小时、12小时及24小时不同时相取材，迅速取出心脏，沿心脏矢状面方向将整个心脏用OCT包埋，液氮骤冷，作全心连续冰冻切片，进行免疫荧光组织化学染色，光镜定位心脏传导系统，采用Leica AD MDW活细胞多维图成像工作站和Leica Qwin图像分析系统对目标因子蛋白荧光强度进行定量，荧光强度用积分灰度（IOD）表示，参考阴性对照标本中荧光强度，灰度值在40～130之间为蛋白阳性表达。

1.5 统计学分析

利用SDS2.2软件对实时定量PCR数据进行分析处理，并导出文件及图像。利用管家基因对目的基因的表达进行校正，得到相对定量结果（相对数值）。结果用平均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果

2.1 心脏传导系统一般指标

两种力竭运动后均有部分大鼠出现心律失常，肉眼观察心脏有不同程度的充血，且反复力竭游泳运动后各时相组心脏重量指数均显著高于其对照组（P<0.05），具体结果参见文献［19］。

2.2 心脏传导系统SSCCNN 55A mmRRNNAA表达

2.2.1 一次力竭运动

如表2所示，一次力竭运动后，窦房结SCN5A mRNA表达运动后各时相组均显著低于其对照组（P<0.01），房室结、浦肯野氏纤维SCN5A mRNA表达各时相组间差异无统计学意义（P>0.05）。

一次力竭游泳运动后心脏传导系统不同部位SCN5A mRNA表达存有差异，运动后即刻、4小时窦房结SCN5A mRNA表达显著低于房室结（P<0.01）和浦肯野氏纤维（P＜0.01，P<0.05），其他时相各部位差异不明显（P>0.05）。

表2 一次力竭运动后大鼠SCN5A mRNA相对表达量变化

2.2.2 反复力竭运动

如表3所示，反复力竭运动后，心脏传导系统窦房结SCN5A mRNA表达在即刻、12小时、24小时时相均显著低于其对照组（P<0.05）。房室结SCN5A mRNA表达各时相组间差异无统计学意义（P>0.05）。运动后24小时浦肯野氏纤维SCN5A mRNA表达显著低于即刻（P<0.05）。

反复力竭运动后心脏传导系统不同部位SCN5A mRNA表达存有差异，运动后即刻窦房结SCN5A mRNA表达显著低于房室结和浦肯野氏纤维（P<0.01）；运动后4小时窦房结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.05）；运动后12小时窦房结显著低于房室结（P<0.05）；运动后24小时房室结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.05）。

表3 反复力竭运动后大鼠SCN5A mRNA相对表达量变化

2.2.3 不同力竭运动后大鼠传导系统各部位SSCCNN 55 AA mmRRNNAA表达比较

2.2.3.1 窦房结

如表2、表3、图1所示，两种不同力竭运动后心脏传导系统窦房结SCN5A mRNA表达各时相组间无显著差异（P>0.05）。

图1 两种不同力竭运动后大鼠窦房结SCN5A mRNA相对表达量比较

2.2.3.2 房室结

如表2、表3、图2所示，不同力竭运动后心脏传导系统房室结SCN5A mRNA表达各时相组间无显著差异（P>0.05）。

图2 两种不同力竭运动后大鼠房室结SCN5A mRNA相对表达量比较

2.2.3.3 浦肯野氏纤维

如表2、表3、图3所示，两种不同力竭运动后心脏传导系统浦肯野氏纤维SCN5A mRNA表达各时相组间比较无显著差异（P>0.05）。

2.3 心脏传导系统SSCCNN 55 AA蛋白表达

2.3.1 一次力竭运动

如表4所示，一次力竭游泳运动后，心脏传导系统窦房结SCN5A蛋白表达即刻和其他时相显著低于其对照组（P<0.01），即刻又显著低于其他时相（P<0.01）。对照组房室结SCN5A蛋白表达显著低于运动后即刻（P<0.05）和4、12小时（P<0.01）。运动后4、12小时显著高于即刻（P<0.01），运动后12小时显著低于4小时（P<0.01），运动后24小时显著低于其对照组和其他时相（P<0.01）。浦肯野氏纤维SCN5A蛋白表达运动后即刻显著低于其对照组（P＜0.01），运动后4小时显著低于其对照组和即刻（P<0.01），运动后12小时显著低于对照组和运动后即刻、24小时（P<0.01）以及4小时（P<0.05），运动后24小时显著高于其对照组和其他时相（P<0.01）。

心脏传导系统不同部位SCN5A蛋白表达在一次力竭游泳运动后存有差异。运动后即刻窦房结SCN5A蛋白表达显著低于房室结和浦肯野氏纤维（P<0.01），房室结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.01）。运动后4小时窦房结显著低于房室结（P<0.05）。运动后12小时浦肯野氏纤维显著低于房室结（P<0.05）。运动后24小时房室结显著低于窦房结和浦肯野氏纤维（P<0.01），窦房结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.01）。

表4 一次力竭运动后大鼠SCN5A蛋白表达总灰度值变化

2.3.2 反复力竭运动

如表5所示，反复力竭游泳运动后，对照组心脏传导系统窦房结SCN5A蛋白表达显著高于运动后各时相（P<0.01），运动后即刻显著低于运动后4和24小时（P<0.01），运动后4小时显著高于运动后24小时（P<0.01），运动后12小时显著低于即刻、4和24小时（P<0.01）。对照组房室结SCN5A蛋白表达显著低于运动后即刻、12小时（P<0.01）和4小时（P<0.05），运动后4小时显著低于运动后即刻和12小时（P<0.01），运动后12小时显著高于运动后即刻（P<0.01），运动后24小时显著低于对照组和其他时相（P<0.01）。运动后即刻和4小时浦肯野氏纤维SCN5A蛋白表达显著低于对照组（P<0.01），运动后12小时显著低于对照组和运动后即刻、4小时（P<0.01），并显著高于运动后24小时（P<0.01），运动后24小时显著高于对照组和其他时相（P<0.01）。

心脏传导系统不同部位SCN5A蛋白表达在反复力竭游泳运动后存有差异。运动后即刻浦肯野氏纤维SCN5A蛋白表达显著高于窦房结和房室结（P<0.01）。运动后4小时房室结显著低于窦房结和浦肯野氏纤维（P<0.01），窦房结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.01）。运动后12小时房室结显著高于窦房结和浦肯野氏纤维（P<0.01），窦房结显著低于浦肯野氏纤维（P<0.01）。运动后24小时房室结显著低于窦房结和浦肯野氏纤维（P<0.01）。

表5 反复力竭运动后大鼠SCN5A蛋白表达总灰度值变化

2.3.3 不同力竭运动后大鼠传导系统各部位SSCCNN 55 AA蛋白表达比较

2.3.3.1 窦房结

如表4、表5、图4所示，两种不同力竭运动后心脏传导系统窦房结SCN5A蛋白表达存有差异。反复力竭运动后即刻、4和24小时均显著高于一次力竭（P<0.01），反复力竭运动后12小时显著低于一次力竭（P<0.01）。

2.3.3.2 房室结

如表4、表5、图5所示，两种不同力竭运动后心脏传导系统房室结SCN5A蛋白表达存有差异。反复力竭运动后即刻和12小时均显著高于一次力竭（P<0.01），反复力竭运动后4小时显著低于一次力竭（P<0.01）。

2.3.3.3 浦肯野氏纤维

如表4、表5、图6所示，两种不同力竭运动后心脏传导系统浦肯野氏纤维SCN5A蛋白表达存有差异。反复力竭运动后即刻、4和12小时均显著高于一次力竭（P<0.01），反复力竭运动后24小时显著低于一次力竭（P<0.01）。

3 讨论

SCN5A是人类电压门控钠通道基因家族的一员，位于染色体3P21，分子量为227kDa，由四个同源结构域（DI-DIV）通过细胞内环相连，每个结构域含有6个跨膜片断（S1-S6），其中S5和S6片段之间的连接环构成通道孔壁，决定通道的离子选择性，氨基端梭基端部在细胞内。SCNSA基因有28个外显子，DNA序列长短不一，最短为53bp（第24个外显子），最长为3257bp（第28个外显子）。钠通道不仅存在于常见的细胞外膜和T管膜，还存在于心脏特殊的缝隙连接。

SCN5A基因表达受多种因素调控。马宁等［20］研究发现，低氧对培养细胞内PKA活性与SCN5A基因表达有一定调节作用，且对PKA的作用早于对SCN5A基因表达的作用，PKA可能参与影响大鼠心肌细胞缺氧后SCN5A基因表达。也有学者研究［21］结果发现，低氧1 h和6 h心肌细胞Na+通道基因SCN5A mRNA表达上调，而在低氧12 h和24 h mRNA表达下调，且与脂质过氧化和SOD相关。

Schott等［22］发现，在一个荷兰家系中SCN5A的缺失突变（del 5280G），提前出现终止密码子，导致非进行性心脏传导阻滞。Olson等［23］应用突变扫描方法对扩心病家系进行扫描，发现突变区域也位于染色体3P，以钠通道sCNSA基因为候选基因对156例受试者进行扫描，发现SCNSA错义突变位点D1275N与年龄依赖性、扩心病家系不同表现型、房颤、自主神经功能失调与传导延缓相关。长QT综合症（LQTs）由心肌细胞钠通道基因SCN5A（Nvl.5）突变引起，已发现至少32个突变位点与LQTs有关。突变体通道失活受损，使内向晚钠电流增加，产生“功能增强”效果导致QT间期延长。本研究发现，力竭运动后SCN5A mRNA与蛋白表达呈下降趋势，并显著低于对照组。目前研究认为，窦房结动作电位没有钠通道参与，钠通道只是参与窦房结周边心房肌细胞的动作电位过程。分析认为，由于一次力竭运动后钾离子通道激活，钠离子通道活性受抑制，表现为低表达趋势。钠通道低表达可能影响其通道开放数量和电流，致使窦房结周边部位细胞动作电位0期有效钠电流减少，细胞膜去极化速度减慢，构成窦性心动过缓发生机制。而反复力竭运动后钠通道亚型改变更明显，更易引发运动性心律失常。结合以上分析，力竭运动后窦房结周边部SCN5A mRNA与蛋白表达下降，可能引起窦房结周边部位细胞动作电位0期有效钠电流减少，细胞膜去极化速度减慢，导致房性传导减慢，钠离子-钾离子通道反复的激活失活，更易引起运动性房颤等心律失常的发生。

研究显示SCN5A的H558R多态位点可增加孤立性心房颤动的易感性［16］，还发现N1986K可以导致心房颤动［17］。本研究发现，一次力竭运动后房室结SCN5A mRNA和蛋白表达呈先升后降趋势，反复力竭后出现两个波峰，但各时相之间差异不明显。一次力竭运动后SCN5A表达代偿性被激活引起上升，随恢复时间的延长，逐渐失活引起下降。SCN5A表达异常可能使无活性通道组合或通道失活，导致动作电位0期有效钠电流减少。细胞膜去极化速度减慢，房室交界区内电流传导速度减慢，发生房室传导阻滞。反复力竭运动后SCN5A激活失活较一次力竭变化更加明显，推测反复力竭运动后更易发生运动性心律失常。综上所述，一次力竭运动后引起心脏传导系统房室结SCN5A mRNA和蛋白表达变化不大，提示力竭运动后房室结钾离子通道的激活，使钾电流活动增强，钠离子通道改变不明显，可能引起房室结细胞膜动作电位动作电位0期有效钠电流减少，去极化时程延长。房室结细胞膜动作电位平台期外向钾电流的减弱，引起平台期缩短，整个动作电位的紊乱，导致细胞膜内外钠离子、钾离子浓度改变，钠-钾交换障碍，动作电位各期复极化紊乱，引发房室传导阻滞，构成运动性心律失常的发生机制。

Benson等［24］发现，在先天性病态窦房结综合征的七个家系中，有三个家系中的5人有复合SCN5A杂合突变，呈常染色体隐性遗传，也被认为是与SCN5A相关的第一个隐性遗传。本研究发现，一次力竭运动后，心脏传导系统浦肯野氏纤维SCN5A mRNA和蛋白表达呈现先降后升趋势，但各时相组间差异无显著性。可能是力竭运动导致钠离子通道活性受抑制，表现为降低趋势。而钠通道开放数量减少，易导致动作电位0期有效钠电流减少，细胞膜动作电位去极化速度减慢。反之，钠离子通道活性增强，引起细胞膜动作电位去极化速度加快，电传导速度加快，从而引发室颤。反复力竭运动后呈下降趋势，且运动后24小时SCN5A mRNA表达显著低于运动后即刻。这提示反复力竭导致细胞损伤加重，造成细胞膜离子通道损伤，易形成折返，引发运动性室性心律失常。

4 总结

力竭运动导致心脏传导系统细胞膜离子通道亚型SCN5A mRNA和蛋白水平异常低表达，其中窦房结改变最明显和持久，其可能引起细胞膜电位改变，诱发心脏起搏和传导功能异常，构成了运动性心律失常的病理与发生机制。

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