全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞PPA Rγ和P-G SK-3β蛋白表达的影响

陈渝 卜淑敏

1 首都体育学院（北京100191） 2 北京体育大学

女性进入绝经期后，卵巢功能逐渐衰竭，易导致骨质疏松症的发生。而绝经后骨质疏松患者骨量减少时，往往伴随着骨髓中脂肪组织增多，这种骨量减少与脂肪的增多可能是由于成骨细胞与脂肪细胞的前体细胞——骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）向两者分化发生改变而产生。去卵巢大鼠是目前通用的模拟研究绝经后骨质疏松症的理想动物模型［1、2］。研究表明，全身垂直振动能减缓去卵巢骨质疏松大鼠松质骨骨量丢失［3，4］，但对其细胞分子作用机制还知之甚少。过氧化物酶体增殖物激活 受 体（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）属核激素受体超家族，含三种亚型（PPARα、PPARγ、PPARδ）［5］。研究发现，抑制PPARγ表达可增加BMSCs向成骨细胞分化，并抑制其向脂肪细胞分化［6］，表明PPARγ能诱导BMSCs向脂肪细胞分化。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthakinase，GSK-3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在哺乳动物中包括两个亚型（GSK-3α和GSK-3β）。研究发现，GSK-3β参与葡萄糖转运、糖异生及脂质代谢等的调节［7］。Wnt/β-catenin信号途径活化是BMSCs向成骨细胞分化的必需条件之一，GSK-3β通过抑制Wnt/β-catenin信号通路下游抑制BMSCs向成骨细胞分化。GSK-3β磷酸化能抑制自身激酶活性，进而激活Wnt/β-catenin信号通路下游，促进成骨细胞分化，提示P-GSK-3β具有诱导BMSCs向成骨细胞分化的作用。鉴此，本实验建立了去卵巢骨质疏松大鼠动物模型，探讨全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠全骨髓细胞和骨髓基质干细胞PPARγ和P-GSK-3β蛋白表达的影响，为揭示振动防治绝经后骨质疏松症的细胞分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Mouse-ant-PPARγ抗体：ZS-7273，中杉金桥生物技术有限公司；Rabbit-GSK-3β抗体（#9315S）和Rabbit-P-GSK-3β抗体（#9336S：美国 Cell Signaling TECHNOLOGY）；马抗小鼠IgG/碱磷酶标记二抗、山羊抗兔IgG/碱磷酶标记二抗和碱磷酶底物BCIP/NBT显色浓缩液：中杉金桥生物技术有限公司；RIPA蛋白裂解液和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液：P0015，碧云天；DSPT-202振动台：北京雅士林生产；LG10-3A离心机：北京离心机厂；电泳仪：DYY-7C型，北京六一仪器厂。

1.2 动物手术与分组

3月龄健康雌性未孕SD大鼠36只，体重（260±12）g，由北京维通利华实验动物中心提供及饲养，动物合格证号SCXK（京）2006-0008。自由饮水和进食，标准啮齿类动物饲料适应性喂养1周后，按体重分层后随机分为假手术组（Sham）、去卵巢静止组（OVX）和去卵巢振动组（OVX-V）3个组。手术前，各组大鼠均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，OVX组和OVX-V组大鼠从背部切除双侧卵巢，Sham组不切除卵巢，只切除卵巢旁与卵巢等大的脂肪组织。无菌手术在北京大学医学部实验动物科学部［SYXK（京）2006-0025］进行，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀，术后自由进食水。实验过程中，OVX组2只大鼠因腹部粘连而于术后2周死亡，最后纳入实验的各组大鼠数目分别为：Sham组12只，OVX组10只，OVX-V组12只。

1.3 全身垂直振动治疗方案

全身垂直振动治疗方案参照Tezval等［3］报道并略做修改。术后休息10周，经双能X线骨密度仪检测OVX组和OVX-V组大鼠在体腰椎骨密度已显著低于Sham组大鼠后，第11周开始进行1周适应性振动训练。振动频率50 Hz，振幅0.9 mm，每天振动2次，每次间隔10 min，持续时间10 min，训练7天。第12周开始正式振动，振动频率90 Hz，振幅0.5 mm，加速度3.8 g，每天振动2次，每次间隔15 min，持续振动15 min，每周振动7天，共振动7周。所有振动治疗均在上午进行，各组大鼠同等条件饲养，每周称量各组大鼠体重1次。

1.4 全骨髓细胞的冲洗和骨髓基质干细胞的培养

腹主动脉取血后，处死大鼠，立即浸泡于75%酒精中10 min，无菌条件下取左侧股骨，仔细除去表面软组织，采用咬骨钳咬除股骨两端，用预先吸入2 ml培养液的5 ml注射器冲洗骨髓腔，将冲洗液置于刻度离心管中，1000 r/min离心6 min。小心弃上清，一部分细胞沉淀置于-40℃保存，用于蛋白提取；另一部分用2 ml含10%胎牛血清的完全培养液悬浮，然后轻轻吹打成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为5×105/ml，将细胞接种于35 mm培养皿中，放入5%CO2、37℃的CO2培养箱内培养，第5天轻轻吸出悬浮细胞，半量换液，以后每2～3天更换培养液1次。

1.5 蛋白提取

在每管全骨髓细胞中加入1 ml蛋白裂解液和10 μl蛋白酶抑制剂混匀，冰面上作用2 h，4℃、13000 r/min离心30 min，取上清，留一部分检测蛋白质浓度，其余蛋白样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）（按4∶1）混匀，沸水煮5 min，4℃、13000 r/min离心30 min，分装后-40℃保存。

骨髓基质干细胞培养9天后用PBS洗2次，加入蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂（100∶1）后用细胞铲子将贴壁细胞铲入液体中，搅拌混匀。其后操作与提取全骨髓蛋白一致。

1.6 Western blotttiinngg

取40 μg蛋白样品上样，以80 V电压，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离约2 h后，以80 V电压转移2 h。在质量分数为5%的脱脂奶粉中室温封闭1 h，将PVDF膜与一抗4℃过夜，次日TBST洗10 min×3，分别加二抗室温孵育2 h，TBST洗10 min×3，在BCIP/NBT显色液中显色至条带出现，放入水中终止显色，拍照，扫描各条带灰度值。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS16.0软件进行统计，结果以均值±标准差表示，进行单因素方差分析。P<0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 全骨髓细胞PPARγ和P-GSK-33β蛋白表达

图2 各组大鼠全骨髓细胞P-GSK-3β蛋白表达比较

2.2 骨髓基质干细胞PPARγ和P-GSK-3β蛋白表达

图3和图4显示，OVX组PPARγ蛋白表达（0.73±0.04）与Sham组（0.72±0.028）比较无显著差异，而PGSK-3β表达（0.82±0.03）与Sham组（0.91±0.10）比较显著降低；OVX-V组PPARγ（0.77±0.04）和P-GSK-3β蛋白表达（0.84±0.01）与OVX组（PPARγ：0.73±0.04，PGSK-3β：0.82±0.03）比较均无显著差异。

图3 各组大鼠骨髓基质干细胞PPARγ蛋白表达比较

图1和图2显示，OVX组PPARγ蛋白表达（0.64±0.04）与Sham组（0.61±0.02）比较无显著差异，而PGSK-3β蛋白表达（0.12±0.02）与Sham组（0.16±0.01）比较显著降低。OVX-V组PPARγ蛋白表达（0.60±0.01）与OVX组（0.64±0.04）比较无显著差异，而PGSK-3β蛋白表达（0.21±0.01）与OVX组（0.12±0.02）比较显著增加。

3 讨论

骨质疏松是女性绝经后的常见骨代谢疾病。绝经后骨质疏松与骨髓细胞向成脂和成骨细胞分化异常有关，骨质疏松患者骨髓细胞有部分细胞被脂肪细胞取代。BMSCs是一种多功能干细胞，具有多向分化潜能，能够向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌膜细胞、成脂细胞及基质细胞分化［8-12］。本实验中，体外培养的OVX组BMSCs的生长状况及细胞形态与Sham组比较无差异，表明去卵巢未改变BMSCs的生长状况和形态，这与相关报道［13］基本吻合。

图4 各组大鼠骨髓基质干细胞P-GSK-3β蛋白表达比较

PPARγ蛋白是一种核转录受体，在骨髓基质干细胞向脂肪细胞的分化过程中起关键作用。林先和等［14］用PPARγ基因转染BMSCs后，细胞PPARγ表达呈阳性，继续培养发现，细胞生长逐渐停止并进入分化阶段，最终分化为脂肪细胞。去卵巢模型研究中，去卵巢小鼠PPARγ基因表达量显著高于假手术组，8周上坡跑有氧耐力训练后，去卵巢大鼠PPARγ基因表达量显著降低［15］。我们前期研究表明［16］，14 周跑台训练后，去卵巢大鼠股骨远端和胫骨近端骨髓腔脂肪空泡数目及股骨PPARγ蛋白表达显著低于去卵巢静止组。本实验中，OVX组大鼠全骨髓细胞和骨髓基质干细胞PPARγ蛋白表达量与Sham组大鼠相比虽增加但均无显著差异。OVX-V组和OVX组大鼠全骨髓细胞和骨髓基质干细胞PPARγ蛋白表达同样无显著性差异。上述提示，一方面，PPARγ在骨组织和骨髓细胞中的表达有部位差异；另一方面，机械振动可能不能调节去卵巢大鼠骨髓细胞PPARγ蛋白表达。

GSK-3β具有多种生物学功能，如参与细胞增殖、细胞分化和脂质代谢的调节［7］。GSK-3β的活性受磷酸化调节，Ser9位点的磷酸化导致GSK-3β失活，促进成骨细胞分化。在前期研究中，我们证实去卵巢显著降低大鼠腰椎P-GSK-3β蛋白表达，而中等强度跑台运动显著增加去卵巢大鼠P-GSK-3β蛋白表达［17］。本实验中，P-GSK-3β蛋白在去卵巢骨质疏松大鼠全骨髓细胞中的表达显著低于假手术组，而全身垂直振动则促进去卵巢大鼠全骨髓细胞P-GSK-3β蛋白表达。这与前期在骨组织中的研究结果吻合，表明P-GSK-3β蛋白在骨髓细胞和骨组织中的表达无差异，均受振动刺激调节。此外，本研究中，去卵巢骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞P-GSK-3β蛋白表达显著低于Sham组，但振动对其无显著影响。这表明全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠全骨髓细胞P-GSK-3β蛋白产生的影响在体外培养后消失，提示探讨振动对去卵巢大鼠骨髓基质细胞如P-GSK-3β蛋白表达的影响不能在体外培养后进行。

4 总结

本实验结果表明，全身垂直振动促进去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞P-GSK-3β蛋白表达，但其效应在体外培养后消失，提示全身垂直振动可能通过促进去卵巢骨质疏松大鼠全骨髓细胞P-GSK-3β蛋白表达而发挥其预防绝经后骨质疏松发生的作用。

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