茯苓结合有氧运动对大鼠基于代谢组学表征的血脂紊乱相关指标的影响

苗华 张旭

西北大学体育教研部（陕西西安710069）

代谢组学作为系统生物学的一部分，是通过测定生物体分泌的各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映生物体代谢网络在药物和疾病作用下的变化规律，这对于揭示药物的代谢模式和复杂性疾病的机理具有独特的优势。代谢组学技术已广泛应用于药物研发、药物毒性评价、临床诊断等领域［1-3］。血脂紊乱是诱发动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心血管疾病的主要危险因素之一。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平增高及血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平的下降与心血管疾病密切相关［4］。文献报道中草药茯苓可用于纠正血脂紊乱［5］。由于有氧运动可显著降低血清TC、LDL-C等水平，并可减轻动脉粥样硬化的临床表现［6，7］，将茯苓结合有氧运动，对血脂紊乱有较好的治疗作用［5］。本研究以大鼠为对象，探讨茯苓乙醇提取物及联合有氧运动对实验性血脂紊乱的干预作用。

1 对象与方法

1.1 动物及分组

健康雄性SD大鼠40只（第四军医大学实验动物中心，动物生产许可证：SCXK（陕）2008-03；动物批号201212006；动物使用许可证号：SYXK 2010-004），随机分成5组，每组8只。A组（正常对照组）普通饲料喂养；B组（模型组）高脂饲料（高脂饲料配方：81%基础饲料，10%蛋黄粉，7.5%猪油，0.3%胆盐，0.2%甲基硫氧嘧啶，1%胆固醇［8］）喂养；C组（茯苓组）高脂饲料喂养同时灌胃茯苓乙醇提取物10 g生药/kg/d；D组（有氧运动组）高脂饲料喂养同时进行无负重游泳训练；E组（茯苓结合有氧运动组）高脂饲料喂养同时灌胃茯苓提取物10 g生药/kg/d，同时进行无负重游泳训练。在实验开始的第1天、第2周末和第4周末分别称体重，实验时间为4周。

1.2 茯苓乙醇提取物

茯苓样品经过干燥、粉碎后，5 kg用约10倍体积的95%乙醇浸泡24 h后开始渗漉，回收乙醇，重新利用。浓缩得棕色膏状物68 g。

1.3 游泳训练

游泳池为圆形，内壁光滑，直径45 cm，水深70 cm，水温25～35°C。运动组大鼠每天无负重条件下游泳2 h，周六、日休息，共4周。

1.4 生化指标测定

在实验开始第1天和第2周末对大鼠进行眼静脉丛取血。第4周实验结束，大鼠经腹主动脉采血，4℃，3000 r/min离心10 min，得上层血清。采用Olympus AU640自动生化仪测定TC、TG、HDL-C及LDL-C等指标；采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和脂质过氧化产物（MDA）。

1.5 代谢组学测定

美国Waters AcquityTM液相色谱仪；美国XevoTMQTof质谱仪；MassLynx V4.1工作站；Acquity UPLC HSS T3色谱柱；流动相为0.1%的甲酸乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～0.5 min，1%B；0.5～3.5 min，1～35%B；3.5～7.0 min，35～99%B；7.0～8.0 min，99%B；8.0～10.0 min，99.0～1.0%B；流速为0.45 ml/min；自动进样器温度4 °C；进样量为2 µL。质谱条件：ESI正离子模式；毛细管电压和锥孔电压分别为3.0 kV和30 V；干燥气流速800 L/h；干燥气温度450 °C。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 基于代谢组学的模型评价

无督导的主成分分析方法在无先验知识的情况下通过样本点在得分图上的分布反映样本的分类信息，结果具有客观性。血清中不同的代谢产物浓度差别较大，浓度高的物质在数据模型中的权重大，这样不利于低浓度生物标记物的发现，因此在模型拟合前应对数据做归一化处理，以利于发现不同组间的差别。代谢组学测定的血脂紊乱主要相关性物质有山梨醇、酪氨酸、柠檬酸、半乳糖、胆固醇、肌酸、鸟氨酸、脯氨酸等［9］。柠檬酸是体内三羧酸循环的中间产物；肌酸是尿中主要非蛋白氮代谢产物之一，其含量与肾功能正常与否关系密切。血清中HDL-C及LDL-C水平可反映脂类在体内的分解与转运以及肝脏脂肪代谢情况，体内脂肪代谢能力下降而肌酸、酪氨酸、鸟氨酸、脯氨酸等多种氨基酸及肌酸含量改变证明存在能量代谢异常。这些物质的变化反映了大鼠出现了糖脂代谢紊乱、免疫功能减弱、凝血功能障碍等一系列的病理变化。图1A和1B是采用PCA（主成分分析）处理的正常对照组和模型组结果，与第2周PCA结果相比，第4周正常对照组和模型组之间的距离增大，说明血脂代谢紊乱加重，推断造模成功。此外，从图1C也可以看到随时间变化血脂代谢紊乱的轨迹，此轨迹也反映了血脂代谢紊乱加重的变化过程。图2采用PLS-DA（偏最小二乘法判别分析）统计处理方法研究正常对照组、模型组与不同干预组。从图2可以看到，不论是茯苓组、有氧运动组，还是茯苓结合有氧运动组都处于正常对照组和模型组之间。此外，还可以观察到茯苓组介于正常对照组和模型组之间，有氧运动组靠近于模型组，而茯苓结合有氧运动组更靠近正常对照组。由此可得出以下结论：（1）血脂紊乱模型成的建立；（2）茯苓、有氧运动及茯苓结合有氧运动均对血脂紊乱有一定的治疗作用；（3）茯苓结合有氧运动组治疗效果优于单一的茯苓组或有氧运动组。

2.2 各组大鼠体重变化

由表1可知：与正常对照组相比，模型组在第2、4周体重均呈现增加的趋势，但无统计学意义；茯苓组、有氧运动组及茯苓结合有氧运动组与模型组相比，体重呈现下降的趋势，但无统计学意义；不同干预组的体重变化接近于正常对照组。

表1 各组大鼠体重比较

2.2 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的变化

由表2可知：第2周和第4周，与正常对照组相比，模型组TC、TG和LDL-C均显著升高（P<0.01，P<0.001）；HDL-C显著降低（P<0.01，P<0.001）。与模型组相比，除第2周有氧运动组TG、第2周茯苓组和有氧运动组HDL-C、第2周有氧运动组LDL-C变化无统计学意义外，茯苓组、有氧运动组、茯苓结合有氧运动组TC、TG和LDL-C均显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；HDL-C显著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。

表2 各组大鼠TC、TG、HDL-C及LDL-C比较

2.3 血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的变化

由表3可知：与正常对照组相比，模型组SOD、GSH-Px均显著降低（P<0.01，P<0.001），MDA显著增加（P<0.001）。CAT变化无统计学意义。与模型组相比，茯苓结合有氧运动组SOD显著升高（P<0.05）；茯苓组、有氧运动组、茯苓结合有氧运动组GSH-Px显著升高（P<0.01）；茯苓结合有氧运动组CAT显著升高（P<0.01）；茯苓组以及茯苓结合有氧运动组MDA显著降低（P<0.01）。

表3 各组大鼠血清SO D、G SH-Px、CA T和M D A比较

3 讨论

代谢组学是系统生物学的一部分，把生物作为一个完整的系统来研究，通过测定生物体分泌的各种体液内代谢物的组成变化来认识和了解生物体代谢网络在药物和疾病作用下的变化规律，这对于揭示药物的代谢模式和复杂性疾病的机理具有独特的优势［10］。病理过程中代谢网络的某些环节出现紊乱，使细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动，这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。因此通过比较正常组与模型组的代谢产物集合轮廓，可以从中得出两者内源性产物种类、浓度、相对比例是否处于相同范围，进而推断造模是否成功。PCA结果证明在4周的时间里，血脂紊乱大鼠造模成功。

茯苓用于调节血脂的相关研究已有报道［11］，药理研究表明，茯苓水提取液可降低过氧化脂质及血清TG、TC、LDL-C，提高HDL-C。本研究发现茯苓可以降低血清TG、TC、LDL-C，提高HDL-C，这与文献报导一致。本研究结果还显示，茯苓可以提高机体SOD、CAT和GSH-Px的活性，同时抑制MDA的产生，加快其清除，从而有效防止机体的脂质过氧化反应，改善脂代谢紊乱的进展。这种作用可能也和其改变机体脂代谢的紊乱、调适机体的脂蛋白组成密不可分。虽然水提取物和乙醇提取物都能够改变这些生化指标，但是水提取物和乙醇提取物的成分有很大不同，水提取物主要含有多糖等极性较大的成分，而乙醇提取物主要含茯苓素（四环三萜类化合物）、麦角甾醇等。这两种提取物是如何促进和提高脂质代谢水平，改善和调节脂质代谢紊乱，有待于进一步研究。

已有研究显示，有氧运动对血脂代谢的影响是通过降低血浆中TC、TG等水平、促进TG的转运和降解实现的，且运动能使胆固醇逆相转运能力增加，引起血液中HDL-C的升高和LDL-C的降低，有利于外周血胆固醇向肝脏转运和降解，从而改善血脂代谢，缓解心脑血管疾病的发生和发展［12，13］。

本研究结果显示，单纯有氧运动对GSH-Px的活性影响较明显，而没有显著降低血清MDA含量，提高SOD和CAT的活力。单一的茯苓仅仅能够上调GSHPx和下调MAD含量，而对SOD和CAT没有显著影响。茯苓结合有氧运动能显著上调血清SOD、GSHPx和CAT含量，同时显著下调血清MDA含量，茯苓结合有氧运动比单一的茯苓或有氧运动能更好改善机体脂代谢紊乱。药物与有氧运动的结合可能是治疗血脂紊乱的一条有效途径。

4 小结

茯苓、有氧运动均能有效调节血脂紊乱机体的脂代谢状况。两者联合作用效果优于单纯补充茯苓或有氧运动。

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