MicroRNA-100对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响*

嵇晓辉， 范秉琳， 张红鸽， 蔡新华， 朱武凌

(新乡医学院基础医学院，河南新乡453003)

MicroRNAs(miRNAs)是一类短小(20～24 nt)的非编码RNA，通过影响mRNA的稳定性和翻译而参与多细胞生物体中基因表达的转录后调控。MicroRNA-100(miR-100)在人类定位于 11q24.1，研究表明它在鼻咽癌、卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤中异常表达，失去对靶基因Polo样激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)的调控，因而Plk1表达上调，这种改变不仅参与癌的发生过程，而且可能与肿瘤的进展密切相关［1-3］。目前尚不十分清楚miR-100对肝癌细胞的生物学作用及其分子机制，本实验采用阳离子脂质体Oligofectamine介导，将人工化学合成的miR-100模拟物瞬时转染人肝癌HepG2细胞中，分析肝癌细胞的增殖活力、细胞周期和Plk1的表达情况，以期能够揭示miR-100对肝癌细胞的作用与机制。

材料和方法

1 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液，置37℃、5%CO2培养箱培养，选用对数生长期细胞进行转染实验。

2 miRNA-100的合成及实验分组

根据 miR-100的核苷酸序列:5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，由大连宝生物公司合成带有荧光素Cy3标记的miRNA-100模拟物以及阴性对照，同时实验附设单纯脂质体对照。

3 细胞转染

按照阳离子脂质体Oligofectamine试剂(Invitrogen)的操作说明进行，将85 μL培养液Opti-MEM与20 μmol/L miR-100模拟物和阴性对照各5 μL充分混和，与脂质体/Opti-MEM混合物再次混合，将最终混合物加入含新鲜Opti-MEM培养基的肝癌HepG2细胞中，转染终浓度为100 nmol/L，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养至24 h、48 h和72 h。

4 细胞增殖抑制率测定

细胞培养于96孔板中，5×103cells/well，培养24 h后进行转染，转染后24 h、48 h及72 h，加入细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液10 μL后继续培养3 h，酶标仪检测波长450 nm处各孔吸光度(A)。细胞生长抑制率(%)=(1－实验孔A值/对照孔A值)×100% 。

5 流式细胞术分析

于4℃、75%乙醇中固定收集细胞8 h。离心后将细胞重新悬浮于含有200 mg/L RNA酶及15 mg/L碘化丙啶的PBS中，室温孵育30 min后，通过流式细胞仪(Beckman Coulter)进行细胞周期分析，检测重复3次。细胞增殖指数的计算方法为:(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)。

6 实时荧光定量RT-PCR检测

采用 Trizol试剂(Invitrogen)提取实验各组HepG2细胞的总RNA，紫外检测仪分别在260 nm和280 nm波长下检测RNA的浓度及纯度。用逆转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。Plk1上游引物5'-CCTCTCACAGTCCTTAATAA-3'，下游引物 5'-TGTCCGAATAGTCTACCC-3'。实验同步以 β-actin作为内参照，上游引物5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3'，下游引物 5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3'。mRNA表达量的分析采用比较Ct数据法(2－ΔΔCt)进行。每组实验重复3次。

7 Western blotting分析

按蛋白提取试剂盒(Thermo)说明书进行并测定浓度，取60 μg蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜。封闭、抗体孵育及显色按照One-Step Western试剂盒(GenScript)说明进行，Plk1Ⅰ抗(Abcom)工作浓度为1∶600，结果采用Quantity One凝胶图像处理软件进行分析。

8 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包进行分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肝癌细胞转染

人工合成Cy3荧光标记的miR-100模拟物转染HepG2细胞，培养24 h后在激光共聚焦显微镜下观察，可见大部分细胞内有红色荧光，见图1，转染效率大于85%。

Figure 1.HepG2 cells transfected by miR-100 mimic(labeled with Cy3 fluorescent dye).图1 Cy3荧光标记的miR-100模拟物转染HepG2细胞

2 肝癌细胞增殖活力

用CCK-8法分析转染后24 h、48 h和72 h的细胞增殖活力，测得实验组和对照组细胞450 nm波长处各孔A值，计算出细胞增殖抑制率，见表1。同对照组细胞相比，实验组细胞在miR-100转染后各时点的增殖抑制率均显著升高(P＜0.01)。

表1 HepG2细胞转染后各检测时点细胞增殖抑制率Table 1.Inhibitory rate of cell proliferation in transfected HepG2 cells(%.Mean±SD.n=3)

3 细胞周期分析

流式细胞术检测结果显示，实验组细胞在转染后72 h G0/G1、S和G2/M期细胞分布发生了改变，S期和G2/M期细胞比例下降，其细胞增殖指数(35.8±1.4)较阴性对照组(39.2 ±1.0)和单纯脂质体组(40.7 ±2.0)减小 (P ＜0.05)。

4 Plk1表达情况

通过qRT-PCR检测和Western blotting相对灰度值分析，在转染后72 h miR-100实验组癌细胞Plk1 mRNA表达水平较各对照组降低，见图2，同样Plk1蛋白表达也明显减少，见图3。

Figure 2.Plk1 mRNA expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfected with miR-100 minic for 72 h.Plk1 mRNA expression was determined by real-time RT-PCR.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs blank control，liposome or negative control.图2 HepG2细胞经转染后72 h Plk1 mRNA的表达分析

讨 论

肝癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一，每年因肝癌死亡约11万人，占全球肝癌死亡总数的45%，严重威胁着人民群众的身体健康。目前在临床上主要有外科切除、化疗、TACE等治疗，尽管它们能延长部分患者的生存时间，但是都不能取得满意的结果。随着在分子水平上对肝癌研究的不断进展，基因治疗成为临床应用前景最为看好的靶向治疗，寻找基于新机制的治疗手段一直是国内外研究的热点［4-5］。

Figure 3.Plk1 protein expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfented with miR-100 minics for 72 h，Plk1 protein was determined by Western blotting assay.A:blank control;B:liposome;C:negative control;D:miR-100.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A，B or C.图3 HepG2细胞经转染后72 h Plk1蛋白表达分析

近年来研究表明，miRNAs在肝细胞癌中表达异常，导致癌基因的激活上调和抑癌基因的功能缺失，从而调控癌细胞增殖和肿瘤生长［6-7］。Li等［8］分析发现在HepG2细胞中miR-224高表达对细胞增殖、分化及转移产生影响，但细胞周期并无明显变化。在本研究中，我们以阳离子脂质体Oligofectamine为介导，用人工合成的miR-100寡聚核苷酸瞬时转染人肝癌HepG2细胞，旨在揭示miR-100对肝癌细胞的生物学作用。经CCK-8方法检测发现，miR-100实验组在转染后24 h、48 h和72 h的细胞增殖抑制率较其它各对照组均有显著上升，说明肝癌细胞的增殖活力受到miR-100的影响而减低。同时流式细胞术分析结果显示，miR-100实验组的细胞周期分布在转染后72h发生改变，处于S期和G2/M期的细胞比例下降，细胞增殖指数减小，说明miR-100的转染引起了肝癌细胞的细胞周期变化。由此可见miR-100参与肝癌细胞的增殖和细胞周期调控。

Plk1是一种有丝分裂调控蛋白，在有丝分裂进展中起到十分重要的作用，其高表达会促进染色体不稳定和非整倍体产生。现已证实Plk1在许多癌症中异常表达，通过shRNA或化学抑制剂阻断Plk1的表达或降低其激酶活性，无论是在体外和体内都可以有效遏制细胞增殖和肿瘤生长，更有意义的是，这种抑制作用可优先杀死癌细胞，而对于正常细胞并无大碍［9-12］，因此Plk1成为一个理想的肿瘤基因治疗新靶点。本实验针对Plk1受miR-100调控，运用转染技术成功建立miRNA干扰模型，经qRT-PCR和Western blotting的检测分析，结果表明miR-100寡核苷酸转染抑制了Plk1基因的表达，势必影响细胞有丝分裂，从而对癌细胞的增殖产生阻滞作用，这为进一步探索肝癌的靶向治疗提供了新的途径。

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