PCR法检测结核分枝杆菌DNA在鉴别克罗恩病与肠结核中的价值*

陈瑜君， 何 瑶， 陈白莉， 毛 仁， 晁 康， 徐萍萍， 曾志荣， 陈旻湖， 胡品津

肠结核(intestinal tuberculosis，ITB)和克罗恩病 (Crohn disease，CD)临床表现有很多相似之处，且病理特征上都具有肉芽肿形成的特点，较难区别2种疾病。克罗恩病是一组发病机制不明的肠道炎症性疾病，其发病机制认为与肠道细菌和环境因素作用于遗传易感的人群，引起异常免疫反应有关。结核分枝杆菌感染作为ITB的病因已明确，因此从病原学检测的角度出发，探索在肠结核患者中直接检测结核分枝杆菌 DNA(Mycobacterium tuberculosis，MTB)快捷有效的方法对鉴别两病重要意义。

ITB是由人型MTB感染所致的特异性肠道炎症。结核菌在感染人体后，多处于潜伏状态，它能在宿主细胞内逃逸宿主的防御作用而大量繁殖，一般情况下，约10%的感染者可发展为致病性结核，在病灶检测到结核杆菌可诊断结核。IS6110［1-2］是 MTB基因组中一个多拷贝的保守片段，有1 361 bp的核苷酸和28 bp的反向末端重复序列，MTB中含有该序列10～20拷贝，具有较高的敏感性。该序列仅存在于人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌(包括BCG)和非洲结核分枝杆菌中，亦具有较高的特异性。根据IS6110设计引物的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)具有高敏感性和高特异性的优点，特别是菌量少时更能显示出该技术的优越性。本研究旨在通过PCR技术检测ITB与CD患者肠道组织的MTB，探索进行快速MTB病原学诊断试验方法在确诊ITB中的可行性及价值，同时为ITB和CD鉴别诊断提供方便快捷的方法。

材料和方法

1 组织标本

石蜡标本来自中山大学附属第一医院病理科2002年～2011年档案保存病例，其中ITB 25例，CD 25例。所有标本通过HE染色切片，由病理学家重新读片确定病理诊断。病人有完整临床病理资料及内镜资料，由消化内科专家重新分析临床资料，确定临床诊断。所有患者取材前未接受抗结核治疗。

2 阳性对照菌株

阳性对照菌株H37Rv标准菌株DNA由广州市胸科医院研究所惠赠。

3 主要仪器

ABI 9700 PCR仪。

4 石蜡组织DNA的提取

肠结核和克罗恩病患者肠道组织DNA提取自石蜡包埋组织，采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取。具体操作如下:(1)从肠结核患者和克罗恩病患者石蜡组织标本中切取8 μm×8张的切片;(2)分次加入适量二甲苯、无水乙醇溶解蜡块，并加入50 μL溶菌酶;(3)加入180 μL的ATL缓冲液;(4)加入20 μL蛋白酶K(protease K)，将离心管放入56℃水浴箱直至组织完全溶解，加长溶解时间，可过夜，此过程需不时振荡离心管以分散组织;(5)依据说明书分次加入Buffer AL、无水乙醇溶解;(6)取上述混合液入QIAamp柱中，据说明书分次加入Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer AE提取DNA。

5 DNA完整性的判断

1.5 %琼脂糖，电压100 V，20 ～30 min。

6 PCR引物的设计与合成

引物采用Primer 5.0软件设计，均由广州英韦创津生物科技有限公司合成。具体序列及片段长度:目的基因IS6110引物正义链5'-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3'，反义链 5'-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3'，目的产物长度123 bp。内参照β-actin引物正义链5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'，反义链5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'，产物长度 106 bp。

7 PCR扩增反应

50 μL 反应体系:PCR Mix 20 μL，ddH2O 6 μL，Primer F 2 μL，Primer R 2 μL，DNA 20 μL。反应条件:预变性 95℃ 5 min，93℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃35 s，35 个循环。

8 电泳

于含有溴化乙啶染色的2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察结果。

9 测序

抽样测序扩增出目的条带的PCR扩增产物，由华大基因测序，采用双向测序。PCR产物测序所得基因序列在 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中比对。

10 质量控制

本实验采用多项措施控制质量，避免污染及减少假阴性:(1)操作过程Eppendorf管开盖操作均在生物安全柜中进行;(2)每轮反应均设置阳性对照和阴性对照;(3)扩增阴性者均重复2次，3次扩增均阴性者方可判断为阴性。

11 统计学处理

选用SPSS 18.0统计软件分析，两组阳性率比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTB DNA PCR有助于确诊ITB

如表1中所示，ITB标本中MTB PCR阳性率为32%(8/25)，CD标本中 MTB PCR阳性率为0%(0/25)。MTB DNA PCR法在ITB和CD鉴别诊断中的灵敏度为32%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值59.5%。而在本组病例中抗酸染色法和病理确诊(干酪样坏死)灵敏度仅分别为8%和12%，PCR敏感性明显高于抗酸染色(P＜0.05)和干酪样坏死(P＜0.05)。

表1 肠结核组与克罗恩病组MTB PCR检测结果Table 1.Positive results of MTB DNA PCR in ITB and CD groups

图1所示为MTB PCR结果，目的电泳条带长度为123 bp。所有阳性对照和阴性对照均出现预期相应的阳性及阴性结果。PCR测序由华大基因完成，采用双向测序，PCR产物测序所得基因序列在Gen-Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中比对，结果显示与电泳结果相符，图2示部分测序结果。

Figure 1.PCR results for MTB DNA detection.1:negative control;2:intestinal tuberculosis sample;3:Crohn disease sample;4:positive control;5:DNA marker.图1 IS6110 PCR扩增结果

Figure 2.Target DNA PCR product sequencing figure(part).图2 PCR扩增出目的条带标本的PCR产物测序图(部分)

2 PCR法阳性率与病理特征的关系

如图3所示，25例ITB患者石蜡切片标本发现肉芽肿的共12例，有肉芽肿标本PCR阳性率为41.7%，无肉芽肿组阳性率为23.1%，但差异无统计学意义(P＞0.05)。进一步分析肉芽肿数目与PCR阳性率间的关系，肉芽肿数目≥2个/切片的标本7例，PCR的阳性率为42.9%，肉芽肿数目=1个/切片的标本5例，2例PCR阳性，差异无统计学意义(P＞0.05)。9例标本可见多核巨细胞，PCR阳性率为44.4%，不含巨核细胞标本的阳性率为25.0%，差异无统计学意义(P＞0.05)。其中1例为仅含离散的多核巨细胞，PCR结果阴性。2例同时含离散多核巨细胞和肉芽肿内多核巨细胞，1例PCR结果阳性。6例多核巨细胞仅位于肉芽肿内，有3例PCR结果阳性。图4示部分典型病理表现。

Figure 3.The relationship between MTB DNA positive rate and pathological features.Big granulomas:diameter ≥200 μm;small granulomas:diameter ＜ 200 μm;multiple granulomas:granuloma number≥2 each specimen.图3 PCR法检测MTB DNA阳性率与病理特征的关系

Figure 4.Typical pathological manifestations of ITB and CD.A(×100)，B(×200)and C(×100)showed caseation necrosis，horseshoe-shaped or wreath-like multinucleated giant cells and dense fused granulomas，respectively，supporting ITB;D(×400)，E(×100)and F(×200)revealed ganglion cells，fissure-like ulcer and loose small granulomas，respectively，supporting CD.图4 肠结核和克罗恩病的部分典型病理表现

讨 论

ITB和CD的鉴别诊断一直是临床难题。如果将CD误诊为ITB，将导致不必要的抗结核治疗和药物毒性，及导致CD的治疗延迟。反之，如果将ITB误诊为CD，采用激素、免疫抑制剂甚至生物制剂治疗可使病情恶化甚至死亡。目前对2种疾病的鉴别诊断主要依据内镜检查和手术标本组织病理，以及诊断性抗结核治疗［3］。而典型临床特征、结核杆菌抗酸染色、结核杆菌培养阳性等仅见于极少数患者，因此作为鉴别诊断依据的价值有限。结核杆菌PCR、小肠CT成像(CTE)和结核感染酶联免疫斑点实验(T.SPOT.TB)成为目前较新的研究热点［4］。

MTB DNA PCR技术在PCR技术将病原体的检测带入了分子生物学时代时已尝试应用于此领域。其优越性体现在:(1)敏感性高，尤其适用于ITB抗酸染色阴性或未见干酪样坏死典型病例表现的标本;(2)特异性高;(3)快速。1989年法国学者Brisson-Noёl等［5］首先报道将 PCR 技术用于诊断结核病。近年国内外多家研究机构已经对PCR技术应用于ITB的诊断做了一些初步的探讨。PCR在ITB的诊断中敏感性一般，但特异性很高。国内以华西为代表的研究机构做出的结果其敏感性可达60%以上［6-9］，国外主要是印度和韩国结核较高发的国家在研究，其做出的敏感性在21.6% ～45.0%。而特异性都高达80%以上［10-12］。我们的研究MTB DNA检查的阳性率为32%，与报道相符。

MTB DNA PCR假阴性的原因主要有:(1)活组织标本:组织中结核分枝杆菌DNA的提取量小于PCR法检出下限。MTB DNA在ITB病人的组织中浓度很低，分布不均匀，且内镜活检组织，钳取组织量少且浅。这些特征导致提取的DNA主要是组织DNA，不能有效地从分枝杆菌中提取结核DNA。(2)石蜡标本:某些石蜡包埋组织陈旧，DNA已降解或破坏;组织的反复冻融也有可能破坏DNA。(3)实验技术:DNA提取时结核分枝杆菌未破解成功，结核分枝杆菌包壁坚韧，裂解困难，不除外提取的主要是组织DNA，部分分枝杆菌未充分裂解释放出DNA。此外不排除商品化的DNA分离试剂则可能移除我们所要检测的部分结核杆菌DNA，这将导致错误的阴性结果。

针对上述可能出现的问题，我们的研究围绕着DNA提取和PCR扩增，建立稳定的实验学方法提高实验可靠性和检出率。(1)DNA提取是结核DNA PCR的关键，增加活检数量和部位［13］，在DNA提取前加入溶解酶，加大蛋白酶K的量、加长溶解时间，尽量增强溶解效果。选用可达到较高浓度和纯度产物的试剂盒。(2)PCR扩增选择MTB基因组中一个多拷贝的保守片段 IS6110 设计引物［1，14］，具有较高的敏感性及高度特异性。(3)其次扩增123 bp片段，避免了大片段因石蜡包埋处理过程的DNA降解、断裂而导致的假阴性。(4)进行质量监控。设立阳性对照和阴性对照，并对结果阴性的标本重复2次PCR扩增。

许多研究探讨分枝杆菌PCR阳性率与病理特征的关系，ITB特异性指标干酪样坏死和抗酸染色阳性率低。大(直径＞200 μm)、致密、融合、边界清的黏膜下肉芽肿倾向ITB。直径小(＜200 μm)、非融合、边界不清、结构排列疏松肉芽肿倾向于CD。多核巨细胞在肠结核和克罗恩病患者均可见。报道提示，PCR的阳性率同病理特征有关［12］，有特征性病理表现的组织PCR阳性率更高。可能与结核分枝杆菌多存在于上皮样肉芽肿形成部位有关。在我们的研究中，PCR的阳性率在有肉芽肿、巨核细胞的标本中较高，但未达显著差异，考虑与样本量小有关。大样本研究、定量PCR和血清学检测［15］等更敏感的方法是今后研究的方向。

PCR法可用于结核分枝杆菌DNA检测，随着分子技术的不断进步，大大缩短了诊断所需时间，敏感性和特异性也不断提高，是确诊ITB以及研究ITB和CD鉴别诊断的一种方便快捷的辅助诊断方法。

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