丹参酮ⅡA磺酸钠对胰腺癌BX-PC-3细胞系增殖与细胞周期调控因子表达的影响*

陈 景， 黄曙方， 肖定璋， 麦丽萍， 彭 琪， 赖沛龙， 陈少贤， 余细勇

(广东省医学科学院，广东省人民医院医学研究中心，广东广州510080)

丹参酮ⅡA磺酸钠(tanshinoneⅡA，TSⅡA)是从唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中分离二萜醌类化合物丹参酮ⅡA，经磺化而得到的水溶性物质，是中药丹参主要有效成分之一。近年研究发现，TSⅡA对肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有显著的抑制生长增殖及杀伤作用［1-2］。目前研究显示细胞周期可影响细胞生长增殖，细胞周期调控因子将参与细胞生长增殖途径，其中cyclin A、cyclin D2等在促细胞生长增殖中扮演重要角色。我们既往的研究表明通过药物下调细胞周期蛋白cyclin D1可显著抑制细胞生长增殖［3］，为进一步阐明TSⅡA抑制细胞生长增殖的机制，本研究以不同浓度的TSⅡA作用于胰腺癌BX-PC-3细胞系，观察TSⅡA抑制 BX-PC-3细胞生长增殖过程中cyclin A和cyclin D2的变化情况。

材料和方法

1 材料

人胰腺癌细胞株BX-PC-3购于中科院上海细胞研究所;TSⅡA购于中国药品生物制品检定所，纯度≥98%(批号:111605-200301);Gibco新生胎牛血清购于英韦创津公司;HyClone DMEM/F12培养基和0.25%胰蛋白酶溶液均购于莱德尔公司;MTT试剂为南京凯基生物公司产品;DAPI试剂盒(Nuclear I-solation and Staining Solution-10;NPE Systems Inc.)，Cell Cycle Staining Solution［MultiSciences;主要成分:碘化丙啶(propidium iodide，PI)50 mmol/L，RNaseA 200 mg/L，四盐酸精胺1 g/L］;兔多克隆cyclin A和cyclin D2抗体购于武汉博士德公司;GAPDH单克隆抗体购于上海康成公司，辣根过氧化物酶标记小鼠IgG及兔IgGⅡ抗购于Santa Cruz;Super ECL Plus购于北京普利莱公司;DMSO试剂购于Sigma，其它均为分析纯试剂。

2 方法

2.1 细胞培养 人胰腺癌细胞株BX-PC-3培养于含10%胎牛血清DMEM/F12培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱常规培养，每3 d换液传代培养，取对数生长期的细胞进行实验，实验细胞起始接种浓度为1×107/L。

2.2 药物处理及实验分组 称取2 mg TSⅡA溶解于1 mL 0.02%二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO;一般认为DMSO＜0.1%时，不引起细胞生物学性状的改变)，使其浓度为2 g/L，过滤除菌保存，临用时以适量的培养液稀释到实验所需浓度。根据预实验结果及文献报道，设5个实验组，各组浓度分别为 0、10、20、30、40 和 50 mg/L，其中 0 mg/L 为空白对照组，其余为干预细胞实验组。

2.3 MTT法测定TSⅡA对人胰腺癌细胞的生长抑制作用 取对数生长期的人胰腺癌BX-PC-3细胞，制成1×108/L的单细胞悬液后以每孔100 μL接种于96孔板，在5%CO2、饱和湿度、37℃孵箱中预培养24 h后加入不同体积的TSⅡA，使最终每组含TSⅡA 浓度分别为10、20、30、40、50 mg/L，每个剂量分别设3个复孔，并设正常细胞作对照组，继续培养。于48 h进行MTT比色实验:每次于实验结束前每孔加入浓度为5 g/L MTT液50 μL，37℃避光培养继续培养4 h，使MTT还原为formazan。每孔加DMSO 100 μL，避光摇匀10 min，使formazan充分溶解，后置于酶标仪570 nm检测吸光度(absorbance，A)值，以空白组平均值调零，根据吸光度计算不同浓度的TSⅡA对胰腺癌细胞的增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(对照组A值－药物作用组A值)/(对照组A值－本底对照组A值)×100%。评价标准:IR＞70%为高度敏感，IR在50% ～70%之间为中度敏感，IR在30% ～50%之间为低度敏感，IR＜30%为不敏感。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 生长状态良好的BX-PC-3细胞换无血清培养基培养12 h，设10、20、30、40、50 mg/L 5个给药浓度，分别加入不同体积的TSⅡA，另设空白血清对照组，培养 48 h后，经0.25%胰酶消化，分别收集细胞于15 mL离心管中，每份细胞密度约1×109/L，PBS洗2次，2 000 r/min离心5 min弃上清液。每份细胞加入1 mL DAPI染液，室温避光染色2 min以上，300目筛网过滤后上机进行检测。通过调节电压在EV直方图中显示BX-PC-3细胞的细胞主群，设门(EV)圈住主群细胞，在FL1直方图中显示EV门中细胞群，将二倍体荧光峰G0/G1峰调至荧光道数为200道处，获取10 000个细胞。将QuantaTMSC MPLCollection软件下获取的数据经QuantaTMSC MPLAnalysis软件以FSC的格式输出，打开细胞周期分析软件Muticycle，导入数据并拟合，进行分析比较。

2.5 Western blotting 将生长状态良好BX-PC-3细胞平均接种到6孔板中，经不同浓度TSⅡA刺激48 h后，将各组细胞用预冷的PBS液洗3次，吸弃PBS液，加入预冷的含抑制剂的细胞裂解液，轻轻摇动5 min后，用一预冷的细胞刮刮下培养瓶壁上细胞，转移细胞悬液到离心管中，冰浴15 min进行裂解.裂解液于4℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清。12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TTBS(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5;0.2%NaCl;0.05%Tween-20)37 ℃封闭1～2 h，分别加入兔抗人cyclin A和cyclin D2多克隆抗体、GAPDH单克隆抗体，4℃孵育过夜。TTBS漂洗5 min×3次;鼠抗辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗(1∶9 000稀释)或者兔抗辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗(1∶9 000稀释)4℃孵育45 min;TTBS漂洗5 min×3次;Super ECL Plus敏感曝光试剂盒曝光底片显影。

3 统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，所有实验数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理。两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用Dunnett t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TSⅡA抑制BX-PC-3细胞增殖

10、20、30、40、50 mg/L TSⅡA 作用48 h 对胰腺癌BX-PC-3细胞的增殖有明显的抑制作用，其A值明显低于空白组，见图1。TSⅡA对BX-PC-3细胞株的生长有抑制作用，细胞存活率随TSⅡA浓度升高而降低，抑制效果呈现浓度依赖性。

Figure 1.Effect of tanshinoneⅡA on BX-PC-3 cell proliferation detected by MTT assay.Mean ± SD.n=3.图1 不同浓度TSⅡA对胰腺癌细胞增殖的抑制

2 TSⅡA对胰腺癌细胞BX-PC-3周期的影响

流式细胞术检测显示，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞逐渐增加，G2/M期细胞明显下降，各浓度用药组与空白对照相比差异均有统计学意义，见图2。

3 Western blotting结果

如图3所示，随着TSⅡA浓度的增加，cyclin A与cyclin D2的表达量呈明显下调趋势。

讨 论

胰腺癌是一种恶性程度极高的致死性疾病，具有难发现、易转移、治疗效果极差的特点且目前治疗手段有限。近年来，已经证实中医药治疗胰腺癌不仅可以减轻症状，还能控制胰腺肿瘤细胞发展。其中TSⅡA抗癌作用可能是通过诱导细胞凋亡途径［4］和介导细胞周期调控因子抑制肿瘤细胞增殖途径［5］来实现，但TSⅡA对胰腺癌的作用效果如何仍不明确。我们前期研究表明通过药物下调细胞周期调控因子cyclin D1可显著抑制细胞生长增殖，本研究表明具有抗肿瘤作用的中药TSⅡA能够有效抑制胰腺癌BX-PC-3细胞增殖，具体机制可能通过细胞周期调控因子cyclin A和cyclin D2介导。

Figure 2.The effects of tanshinoneⅡA at different concentrations for 48 h on cell cycle of BX-PC-3 cells detected by FCM.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group(0 mg/L).图2 不同浓度的TSⅡA作用于BX-PC-3细胞48 h后细胞周期分布的变化

Figure 3.Cyclin A and cyclin D2 protein expression in BX-PC-3 cells 48 h after treatment with tanshinoneⅡA at different concentrations determined by Western blotting.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group(0 mg/L).图3 不同浓度的TSⅡA处理48 h后BX-PC-3细胞cyclin A与cyclin D2的表达

我们采用流式细胞术检测不同浓度的TSⅡA对BX-PC-3生长周期的影响，发现处于低药物浓度时，细胞停留在G0/G1期的比例与对照组相比变化不大，但当药物浓度达到40 mg/L甚至以上时，细胞停留在G0/G1期的比例较对照组明显升高。而TSⅡA应用后，G2/M期比例呈现明显下降，并且随着浓度增加，细胞停留在G2/M期的比例呈现明显剂量依赖的下降关系。正常组织细胞的周期存在G0/G1期和G2/M期转换2个限制点，这2个点使细胞的增殖与凋亡处于一种微妙的平衡状态。而在肿瘤细胞中，这种平衡状态被打破，肿瘤细胞无限制地增殖。所以，干扰肿瘤细胞的周期，使肿瘤细胞生长速率减慢，这将从本质上达到抑制肿瘤的效果。本研究结果提示TSⅡA能阻滞胰腺癌细胞于G0/G1期，从而达到抑制细胞增殖的效果。

Cyclin A是细胞周期的正性调控因子，属于M期周期蛋白，具有调节DNA合成和促进细胞有丝分裂的双重作用［6］。Cyclin A的异常表达，可直接或间接地促进G1/S期转换，启动DNA合成，而引起细胞异常增殖［7］。Cyclin D2是调节G1期的细胞周期蛋白cyclin D家族的成员之一，与细胞周期G1/S期转换有关，主要是启动S期，其异常或不恰当的表达可破坏细胞周期。我们采用Western blotting进行检测，发现随着药物浓度的增加，细胞周期调控因子cyclin A和cyclin D2蛋白合成下降，使细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖。这一结果与BXPC-3细胞生长阻滞在G0/G1期是一致的。

我们通过研究发现，TSⅡA对胰腺癌细胞BXPC-3细胞的生长具有明显抑制作用，而且随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞逐渐增加，G2/M期细胞明显下降，并且cyclin A和cyclin D2的蛋白表达也随之明显下调，说明TSⅡA对胰腺癌细胞BX-PC-3细胞的G2/M期检查点功能可能是通过调控cyclin A和cyclin D2来完成的。本实验证明，TSⅡA抑制胰腺癌细胞增殖的根本机制可能在于使胰腺癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞分裂增殖，具有良好的抑制胰腺癌细胞增殖作用，在治疗胰腺癌方面具有较好的应用前景。

［1］ 钟志宏，陈文贵，柳永和，等.丹参酮ⅡA抑制HepG2细胞生长及诱导其凋亡的实验研究［J］.中南大学学报:医学版，2007，32(1):99-103.

［2］ Zhou L，Chan WK，Xu N，et al.Tanshinone IIA，an isolated compound from Salvia miltiorrhiza Bunge，induces apoptosis in HeLa cells through mitotic arrest［J］.Life Sci，2008，83(11-12):394-403.

［3］ 罗 琼，姜 傥，陈 景，等.丙型肝炎病毒核心蛋白对HepG2细胞生长周期的影响［J］.中国病理生理杂志，2012，28(4):631-637.

［4］ 王 炎，李 琦，范忠泽，等.丹参酮ⅡA对人胰腺癌细胞凋亡的诱导作用及其对SAPK/JNK信号转导通路的影响［J］.世界华人消化杂志，2011，19(10):1028-1033.

［5］ 肖建勇，谭宇蕙，张广献.丹参酮IIA对肾癌786-O细胞生长抑制作用及其分子机制［J］.中药新药与临床药理，2012，23(2):136-139.

［6］ Jarnagin WR，Klim stra DS，Hezel M，et al.Differential cell cycle regulatory protein expression in biliary tract adenocarcinoma:correlation with anatomic site，pathologic variables，and clinical outcome［J］.J Clin Oncol，2006，24(7):1152-1160.

［7］ 黄宇旸.p27在恶性肿瘤中的表达［J］.外科理论与实践，2007，12(6):604-606.