大鼠视皮质神经元核呼吸因子的兴奋依赖性表达研究

陈翔，赵晓

核呼吸因子(nuclear respiratory factors，NRFs)是一类由核基因编码的能调控线粒体呼吸链表达的转录因子。作为一类重要的转录调节因子，NRFs在线粒体基因组(mtDNA)及核基因组(nDNA)编码的呼吸链亚基的协调表达中起着重要作用，参与细胞能量代谢。研究发现，神经元内多种基因的表达具有兴奋依赖性，且不同的基因在兴奋刺激后表达变化的模式各有不同[1-3]。对于体外培养神经元，通常采用提高培养液KCl浓度的方法，模拟生理状态下神经元的去极化状态。既往研究发现，对视皮质神经元施加KCl刺激后，神经元内的NRF-1 mRNA表达增加，撤除刺激后，表达明显下降，证明NRF-1 mRNA的表达具有兴奋依赖性[4]，且神经元中NRF-2 mRNA和蛋白表达水平随细胞色素氧化酶活性的升降而产生相应的同向变化[4-5]。但是，对于采用KCl模拟生理刺激后NRFs表达变化的时间规律，目前尚无相关报道。为了进一步研究视皮质神经元内NRFs兴奋性依赖性表达的信号通路，进而深入了解正常视觉信号对线粒体功能的调控作用及视力发育的内在机制，本实验采用原代培养的乳大鼠大脑视皮质神经元，施加兴奋性刺激(KCl)，在刺激后1、3、5、7、10h收集细胞，行RT-PCR检测，观察神经元内过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子-1 (PPAR γ coactivator-1，PGC-1)、NRFs以及线粒体转录因子(mitochondrial transcription factor，mtTFA)基因表达的一系列变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 DMEM、胎牛血清、Neurobasal medium、B-27、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；D-Hanks、L-多聚赖氨酸、Arc-C购自美国Sigma公司；L-谷氨酸、L-谷氨酰胺购自华美生物工程公司；Trizol、DAPI、MitoTracker Red CMXRos购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、Real-time PCR试剂购自日本TaKaRa公司；NeuN购自美国Millipore公司；HRP标记羊抗鼠Dako EnvisonTM检测试剂盒购自美国DAKO公司。SD乳鼠(出生后1d)购自第四军医大学动物实验中心。

1.2 神经元的体外培养 以浓度为25μg/ml的多聚赖氨酸包被无菌塑料培养皿(直径60mm)，置37℃恒温孵箱过夜，采用无菌去离子水洗涤3次，每次3min，洗涤后置于孵箱晾干备用。将出生后1d的SD乳鼠经75%乙醇消毒，充分麻醉，断头处死，沿矢状线剪开头皮及颅骨，用解剖镊将大脑及小脑完整取出，置于预冷的D-Hanks液中，于体视显微镜下剥去软脑膜。视皮质位于大脑枕区背侧面，约2mm×3mm大小，用锋利手术刀片切除相应区域，深2～3mm，用纤维剪剪成约1mm3碎组织块，以上操作均于冰上进行。加入0.25%胰酶浸没组织块，于37℃消化10min，移除胰酶，加入含10%FBS的DMEM终止消化，用巴斯德滴管吹打15次左右，静置，待剩余组织沉淀后，将细胞悬液以105/cm2的密度接种于经多聚赖氨酸包被的培养皿中，3h后全量换液为Neurobasal+B27培养液，24h后在培养液中加入Ara-C(终浓度10μmol/L)抑制胶质细胞生长，按以上方法培养，待神经元纯度达95%以上时备用。

1.3 KCl干预 采用预先配制好的含KCl(终浓度25mmol/L)的培养液替换原有培养液，在刺激后1、3、5、7、10收集细胞。

1.4 RT-PCR检测 取原代培养5d的神经元，加入Trizol试剂，按说明书提取组织总RNA，使用DRR037S试剂盒行反转录。RT-PCR反应以18S RNA作为内参照，引物序列如下：NRF-1正向5'-AAAAGGCCTCATGTGTTTGAGT-3'，反向5'-AGGGTGAGATGCAGAGAACAAT-3'，产物大小93bp；NRF-2α正向5'-AGGTGACGAGATGGGCTGC-3'，反向5'-CGTTGTCCCCATTTTTGCG-3'，产物大小604bp；NRF-2β正向5'-CTGTGGATGGTGCAATT CAG-3'，反向5'-GCTGGTGGCTCTTCACTGAT-3'，产物大小112bp；mtTFA正向5'-GAAAGCACAAATCA AGAGGAG-3'，反向5'-CTACTTTTCATCATGAGACA G-3'，产物大小175bp；PGC-1α正向5'-AGTGTGCTG CTCTGGTTGGTG-3'，反向5'-GGAGGGTCATCGTT TGTGGTC-3'，产物大小610bp。PCR反应过程以无cDNA样品的空白管为阴性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，恒压100V、30min，凝胶成像系统成像，结果经Gel-Pro Analyzer 4.5软件定量分析。检测重复3次。

1.5 统计学处理 采用SAS 12.0软件进行统计学分析。计量资料呈非正态分布，采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行比较，组间两两比较采用Mann-Whitney U非参数检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

KCl刺激后NRFs基因各亚型的表达变化模式各不相同：NRF-1于刺激后3h达高峰，之后表达降低，7h时再次升高达峰值，之后出现下降，呈双峰形态。NRF-2α于刺激后持续升高，至3h达高峰，5h降低，7h再次升高并维持在该水平。NRF-2β在7h达到峰值，其余时间点虽有显著升高且表达水平相近，但均低于峰值。NRF-1的变化较NRF-2更为显著(图1A)。mtTFA的表达于刺激后升高持续至3h，5h表达降低，7h时再次升高达峰值后出现下降，呈双峰形态(图1B)。PGC-1的表达经历两次渐进式升高，于10h达到峰值(图1C)。

3 讨 论

NRFs是一类DNA转录调节因子，能激活编码细胞色素氧化酶及其他呼吸酶各亚基基因的转录，促进线粒体增殖，与线粒体能量代谢密切相关，此外，还在机体接受生理刺激、增强能量代谢的过程中起着重要作用。

在NRFs的兴奋依赖性研究中，我们提高了细胞培养液KCl的浓度(25mmol/L)，结果发现，NRFs基因表达在KCl刺激后1h有明显升高，在观察时间内，表达水平虽有起伏，但均高于对照组，证明神经元兴奋性增高可使NRFs mRNA表达增高，视皮质神经元中NRFs mRNA的表达具有兴奋依赖性。同时，兴奋引起的NRFs mRNA表达随时间延续而变化。NRF-1在细胞中的转录和表达水平与细胞的线粒体能量代谢密切偶联，呈正相关关系，其转录水平增高，线粒体氧化磷酸化功能增强，对体外培养的大鼠视皮质神经元，模拟生理刺激时的细胞外液变化(增加神经元培养液中KCl浓度)，能使NRF-1蛋白表达增加[4]。其中，在刺激后7h，NRF-1、NRF-2β表达达到峰值，而NRF-2α于刺激后3h达高峰，并与对照组及其前后相邻时间点有明显差异，为我们在下一步研究中施加干预因素，阐明NRFs的调控机制奠定了基础。

图1 KCl刺激后乳大鼠大脑视皮质神经元NRFs(A)、mtTFA(B)和PGC-1(C)mRNA的表达变化Fig. 1 Expressions of NRFs (A), mtTFA (B) and PGC-1 (C) mRNA aた er KCl stimulation in rat's visual cortex neurons

在各基因的表达变化中，以NRF-1在1h时的升高最为明显，这在一定程度上验证了如下假设，即NRF-1在外界刺激下的变化较NRF-2α、NRF-2β更为迅速，对外界刺激更加敏感。这也提示我们，视皮质内的NRFs具有不同的反应模式，在刺激的应答反应中可能发挥着不同作用。既往研究发现，KCl刺激还能引起与NRFs功能紧密相关的一系列基因的变化[6]，但目前这些基因兴奋依赖性调节的具体时间模式尚无报道。近年来的研究表明，神经细胞对外界刺激的应答需要一些特定基因的表达。短暂的刺激与长期的表型变化有着一定的联系，这其中需要基因表达的改变，同时也必然存在着一种或多种机制，将细胞表面刺激与神经元转录调节装置偶联起来，从而对细胞分化和可塑性发挥重要作用[7]。本研究对NRFs上游基因PGC-1及下游基因mtTFA mRNA兴奋依赖性表达变化进行了观察，对于我们进一步了解NRFs的调节机制，及其与相关基因的相互作用具有重要意义，也为我们进一步阐明视觉剥夺性弱视的发生机制、寻求可能的干预措施提供了依据。

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