FIZZ1对大鼠主动脉内皮细胞血管新生的促进作用及其机制探讨

李晓燕，房洁，张红明，韩淑芳，高玉琪，晋群

抵抗素样分子α(found in inflammatory zone 1，FIZZ1)是一种与炎症相关的缺氧诱导有丝分裂因子，在小鼠慢性低氧肺模型中显著高表达，因此也被称为低氧诱导的有丝分裂因子(hypoxia- induced mitogenic factor，HIMF)[1]。在缺氧、炎症等状态下，外周血的单核细胞和激活的巨噬细胞中FIZZ1表达显著升高[2]。FIZZ1具有刺激肺动脉平滑肌细胞增殖、收缩血管、促进肺微血管新生和刺激肌纤维母细胞分化等功能[3-4]。有研究表明，FIZZ1可促进内皮细胞分泌血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和血管内皮生长因子(VEGF)[5]，故推测其可能具有促进内皮细胞血管新生的作用。血管新生指在原有血管基础上通过内皮细胞增殖和分化，以芽生或非芽生的形式生成血管，虽然在很多情况下血管新生能改善组织器官供血，但粥样斑块内的血管新生可促进稳定型斑块向不稳定型斑块发展，如果发生在冠状动脉则可能危及生命，引起急性心肌梗死。本研究利用重组FIZZ1蛋白刺激体外培养的大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)，采用动脉内皮细胞管腔形成实验以及全基因表达谱芯片分析的方法，探讨FIZZ1对内皮细胞血管新生的影响及其机制，以期为冠心病的诊治提供思路。

1 材料与方法

1.1 动物来源和主要仪器试剂 健康3～4周龄Wistar大鼠，体重80～100g，由山东大学齐鲁医院心血管研究中心动物房提供。ECM液体培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清、0.25%细胞消化胰蛋白酶溶液(美国Gibco公司)；肝素、明胶(美国Sigma公司)；兔抗大鼠CD31抗体(北京博奥森公司)；SABC-Cy3试剂盒(武汉博士德公司)；重组FIZZ1(美国Santa Cruz公司)；Matrigel胶(美国BD公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；杂交炉、Agilent扫描仪(G2565B)、单标Agilen大鼠全基因表达谱4×44K芯片(美国Agilent公司)；分光光度计(ND1000，美国Nanodrop公司)。

1.2 方法

1.2.1 动脉内皮细胞的培养与鉴定 采用贴块法。Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(10mg/ml)麻醉成功后，注射肝素钠(100U/ml)0.5ml，切开腹腔，游离主动脉，将其浸泡于含1000U/ml肝素钠和20%FBS的ECM培养基中。去除残余的血管鞘脂肪和结缔组织，并将其剪成宽约2mm的血管环，置于2%明胶预包被的培养皿中，加入含有20%FBS、100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、100U/ml肝素钠的DMEM培养基，置于50%CO2(V/V)、37℃培养箱中培养。待细胞长至80%～90%融合时，采用0.25%胰酶消化法进行传代培养。取动脉内皮细胞爬片，以CD31(1:200)作为一抗，采用SABC法进行免疫荧光染色(Cy3标记，红色荧光)。荧光显微镜观察染色结果。实验采用3～5代细胞。

1.2.2 动脉内皮细胞管腔形成实验 重组FIZZ1蛋白用含1%FBS的ECM培养基溶解，用于以下分组实验。①A组：对照组，含1%FBS的ECM；②B组：单倍FIZZ1刺激组，终浓度为5×10–9mol/L；③C组：2倍FIZZ1刺激组，终浓度为1×10–8mol/L；④D组：4倍FIZZ1刺激组，终浓度2×10–8mol/L。将300μl的Matrigel涂于24孔细胞培养板底部，37℃培养1h使其成胶。选择生长旺盛、80%～90%融合生长的RAECs消化备用。用含1%FBS的ECM培养基将细胞浓度调整为2×105/ml，将细胞悬液加入铺有Matrigel的24孔板中，每孔500μl。按前述分组分别加入相应浓度的FIZZ1和含1%FBS的ECM，每组设3个复孔，将24孔板放入培养箱中，6h后观察，24h后倒置显微镜(×200)下观察管腔形成情况并拍照。每孔随机选取5个视野计数管腔形成数，取平均值进行分析。

1.2.3 动脉内皮细胞全基因表达谱检测 总RNA的提取、纯化：将RAECs以4×105/孔的密度接种至6孔板，培养24h后换用无血清培养基静止24h，然后根据组别施加不同干预：①正常对照组，用等量含10%FBS的ECM培养基培养细胞；②FIZZ1刺激组(后称实验组)：用终浓度为5×10–9mol/L的FIZZ1刺激培养细胞，12h后吸出培养液停止刺激。加Trizol分别提取以上两组RAECs的总RNA，使用苯酚/氯仿层相分离法纯化总RNA，再对其进行沉淀和洗涤。分别将两组的总RNA等量完全溶解于Mili-Q水中，－80℃冻存待用。

cRNA标记与合成：运用反转录法荧光标记提取的样本RNA，均用Cy3单标标记。具体步骤如下：向去RNA酶EP管(1.5ml)中分别加入实验组及正常对照组标本RNA各2μg，加入引物5μl，用RNase-free水补足至11.5μl，充分混匀，60℃水浴10min，冰水冷却5min。再分别加入DDT(浓度为100mmol/L) 2μl、DNTP 1μl、Buffer 4μl、RNase OUT 0.5μl，MMLV RT 1μl，共计8.5μl，混匀、离心，热盖65℃、40℃反应2h，以合成各组cRNA。然后用aaUTP标记合成的cRNA，并通过Raeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。

芯片扫描和数据处理：芯片杂交结果采用Agilent G2565B荧光扫描仪进行扫描，Agilent Feature Extraction (Version 10.7.3.1)软件读取数据，扫描仪分辨率为5μm，光电欧联管分别设置为100%和10%各扫描1次，其扫描结果由Agilent软件自动合并，所得结果采用Feature Extraction进行均一化处理。实验组和正常对照组芯片的平均信号强度与平均背景的比值均大于3，符合Agilent基因表达谱芯片的成功标准。确定差异表达的基因，筛选两个样本之间的倍数变化。默认阈值≥2.0倍。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，Matrigel小管形成实验所得的小管数以s表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。基因芯片所得的差异基因利用GeneSpring GX Version 11.5.1软件包(Agilent Technologies)进行标准化和聚类分析，采用Gene Ontology(http://www.ncbi.nlm.nib.gov)功能分类标准对差异基因进行功能分类分析。

2 结 果

2.1 重组FIZZ1对RAECs管腔形成的影响 由图1可见，重组FIZZ1能明显促进RAECs体外血管新生管腔的形成，且在5×10–9～2×10–8mol/L实验浓度内呈剂量依赖性，以2×10–8mol/L FIZZ1作用最明显。A、B、C、D组形成的管腔数目分别为19.7±2.6、22.6±2.9、28.5±3.3、36.9±5.0个/HP，各实验组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 全基因表达谱芯片杂交及生物信息学分析结果 实验组及正常对照组芯片杂交结果分别采用Agilent G2565B荧光扫描仪进行扫描，结果提示有明显差异(图2)。利用软件包对差异表达基因进行标准化和聚类分析后发现22条有显著性差异的信号通路，包括活性上调信号通路12条，如调节细胞肌动蛋白骨架通路[regulation of actin cytoskeleton pathway(rno04810)]等，活性下调信号通路10条，如上皮细胞细菌侵入通路[bacterial invasion of epithelial cells(rno05100)]等。表1和表2列出实验组活性上调及下调最显著的前5个信号通路及其相应功能和基因。

图1 各组RAECs体外新生血管管腔形成(×200)Fig. 1 In vitro neoangiogenesis in Matrigel in 4 groups of RAECs (×200)

图2 基因芯片杂交结果(Agilent G2565B荧光扫描仪)Fig. 2 Hybridized Agilent DNA microarray (part number G2505B)

3 讨 论

FIZZ1是由111个氨基酸残基构成的分泌型蛋白，分子量为9.4kD，其结构分为3个区域：N端信号序列、不固定的中间部分、高度保守的半胱氨酸重复基序(1CX l12CX83C X4CX35CXl06CX7CX8CX99C10C)构成的独特的C末端功能区。FIZZ1的C末端功能区与Resistin家族其他成员一致，故又被称为抵抗素样分子α(resistinlike molecules alpha，RELMα)。FIZZl具有明显的分布特异性，主要位于肺泡上皮细胞、白色脂肪组织、心脏，在外周血单核细胞、活化的巨噬细胞及动脉粥样硬化斑块中也有显著表达[6]。

表1 FIZZ1刺激后RAECs中活性上调的部分信号通路Tab. 1 Pathway up-regulation of RAECs after FIZZ1 stimulation

表2 FIZZ1刺激后RAECs中活性下调的部分信号通路Tab. 2 Pathway down-regulation of RAECs after FIZZ1 stimulation

目前研究结果表明，FIZZ1具有刺激肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移，收缩血管，刺激肌纤维母细胞分化等功能[3-4]，在肺纤维化、哮喘、缺氧、矽肺等疾病的致病机制中具有重要意义，但其是否能促进内皮细胞血管新生目前国内外均未见报道。Tong等[5]研究表明，FIZZ1具有刺激内皮细胞分泌血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的功能，其中VEGF能明显刺激血管新生，FIZZ1通过PI3K-AKt-NF-κB信号通路可进一步诱导VEGF表达[7]。然而Teng等[4]已证实PI3K的抑制剂LY294002仅能部分抑制FIZZ1引起的肺血管平滑肌细胞增殖、迁移，提示PI3K/Akt并非FIZZ1刺激血管平滑肌细胞增殖、迁移的唯一通路。Yamaji-Kegan等[8]的研究表明，FIZZ1能促进肺微血管内皮细胞血管新生，抗VEGF抗体仅能部分抑制血管新生，提示FIZZ1刺激血管新生可能依赖于多种途径。上述研究提示FIZZ1可促进主动脉内皮细胞血管新生，且机制复杂多样。

本研究结果显示FIZZ1对RAECs血管新生管腔形成具有明显的促进作用，且在5×10–9～2×10–8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性地增加新生血管管腔形成的数目，说明FIZZ1可明显促进RAECs新生血管的形成。既往研究表明，FIZZ1在鼠动脉粥样硬化斑块内呈阳性表达，粥样斑块内的血管新生可促进斑块进展及其并发症的发生，动脉粥样硬化的早期即有内膜新生血管形成，斑块内高通透性的新生血管是产生脂蛋白的主要来源，导致大纤维帽覆盖下的斑块不断聚集，且斑块内新生血管管壁发育不完善，易导致斑块出现裂隙、破裂，随之出现血小板黏附、聚集和血栓形成[7]。以上问题与斑块内出血、斑块破裂、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死和心源性猝死的发生高度相关[9]。

为进一步探讨FIZZ1刺激血管新生的机制，本实验运用大鼠全基因表达谱基因芯片杂交技术分析FIZZ1刺激后信号通路的表达变化，结果显示与对照组比较差异明显。GeneSpring GX软件分析结果显示，其中12条信号通路活性上调，如调节细胞肌动蛋白骨架途径[Regulation of actin cytoskeleton pathway (rno04810)]、缝隙连接信号通路[Gap junction pathway(04540)]等。其中调节细胞肌动蛋白骨架途径(rno04810)的活性上调与对照组差异最为明显，提示该途径的活化可能参与了FIZZ1刺激内皮细胞血管新生。细胞肌动蛋白骨架途径是使细胞发生运动迁移的重要组成部分，在细胞突破基底膜建立新生血管腔时，细胞骨架构象的变化不可或缺[10]。正因为FIZZ1激活RAECs的肌动蛋白骨架途径，才使其运动迁移能力增强，更容易突破基底膜形成新生血管。缝隙连接则是存在于相邻细胞间的膜通道结构，由细胞膜上的连接子相互衔接而成，每个连接子由6个相同的蛋白亚单位(Cx)组成，主要参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程具有重要意义。Cx家族中的Cx43表达上调，数量增加，可促进炎症反应的发生和发展，造成内皮细胞及平滑肌细胞的迁移[11]。所以FIZZ1还可能通过细胞缝隙连接途径的活化促进RAECs血管新生。

综上所述，本研究探讨了FIZZ1刺激RAECs后促进其血管新生的能力及其机制，发现除P13K/Akt通路外，FIZZ1还可能通过细胞肌动蛋白骨架途径促进RAECs的血管新生。关于FIZZ1刺激RAECs后细胞肌动蛋白骨架途径活化促进血管新生的具体信号转导通路仍有待进一步研究阐明。

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