莪术挥发油中莪术二酮、吉马酮在大鼠体内的药动学研究

季 德，毛春芹，李金慈，陆兔林*，谢 辉，姜国非，肖永庆

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210023;2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和温郁金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，具有行气破血、消积止痛之功效［1］。现代药理学研究表明，莪术具有较好的抗肿瘤、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗早孕、抗菌、保肝、抗银屑病、抗纤维组织增生等多种药理作用［2］。莪术药材中主要含有挥发油类和姜黄素类两大活性成分，其中莪术油(Zedoary turmeric oil，ZTO)临床应用较广泛，在抗肿瘤、抗血栓方面成效显著［3］。目前国内外对莪术挥发性成分的体内药动学研究主要集中于吉马酮［4-5］、β-榄香烯［6］和莪术醇［7］，且以气相色谱法和毛细管气相色谱法研究为主。前期研究表明，莪术二酮和吉马酮是莪术油中含量较高的主要有效成分，文献报道其具有良好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓和镇痛抗炎的作用［8-9］，常作为莪术药材及莪术油质量控制的指标性成分。但目前未见有同时测定大鼠血浆中莪术二酮和吉马酮含量的方法并进行药动学研究的报道，因此本研究选择莪术二酮和吉马酮为对象，建立了HPLC同时测定大鼠血浆中莪术二酮、吉马酮的方法，并通过单次灌胃给予莪术挥发油乳剂后，研究了莪术二酮、吉马酮在清醒大鼠体内的药动学特征，为莪术的临床安全应用及进一步阐明其作用机制提供现代科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂 温莪术生饮片(安徽丰原铜陵中药饮片有限公司供原药自制;药材产地为浙江;批号cw100409)经南京中医药大学药用植物教研室巢建国教授鉴定;莪术二酮对照品(上海沪云医药开发有限公司，批号13657-68-6)，吉马酮对照品(中国药品生物制品检定所，批号111665-200902)，乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)包括:四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;色谱柱为依利特 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5μm)(大连依利特分析仪器有限公司);预柱:依利特佳杰 C18柱(大连依利特分析仪器有限公司);XW—80A微型涡旋混合仪(上海精科实业有限公司)、TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂);KQ—500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BS110电子分析天平(MettlerToledo，Switzerland);Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore Inc.USA)。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，10只，雌雄各半，体质量(250±20)g(上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号:SCXK(沪)2007-0005)。实验前于南京中医药大学实验动物中心适应性饲养一周，以适应本实验室环境，实验室温度维持20～25℃，相对湿度70%左右，实验前24 h禁食，自由饮水。

2 方法与结果

2.1 莪术挥发油给药样品的制备 取温莪术生饮片，粉碎过3号筛，照2010版《中国药典》附录X D挥发油测定法甲法水蒸气蒸馏法(SD法)提取莪术饮片中挥发油(其中莪术二酮、吉马酮含量分别为8.6248%和6.0793%)，取7.5 g预先经无水Na2SO4脱水的莪术挥发油，置于50 mL量瓶中，加入2.5 g吐温－80作乳化剂，加灭菌水至刻度，混合均匀，超声10 min，制成均一稳定的白色乳状液(莪术油质量浓度为0.15 g/mL)，用前摇匀即得。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取莪术二酮、吉马酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，经稀释后制得莪术二酮质量浓度为137.28μg/mL，吉马酮质量浓度为25.24μg/mL的混合对照品贮备溶液，4℃冷藏备用。

2.3 血浆样品的采集与处理 清洁级SD大鼠6只，雌雄各半，体质量(250±20)g，实验前24 h禁食不禁水，各眼眶取空白血0.5 mL，灌胃给予制备好的莪术油样品2 mL，分别于0.5、1.0、2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、12.0、18.0、24.0 h共13个时间点处各自眼眶取血0.3 mL至预先加入适量枸橼酸钠抗凝剂的Eppendorf离心管中，5000 r/min离心10 min。吸取上层血浆50μL，精密加入乙腈100μL，涡旋混合2 min，14000 r/min离心 10 min，吸取上清液100μL置于进样瓶中，HPLC 自动进样 40μL测定。

2.4 色谱条件 以Elite Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);乙腈(A) － 水(B)为流动相，进行梯度洗脱，0～20 min，50% ～80%(A);下一个梯度前用100%(A)冲洗色谱柱10 min，继续用50%(A)平衡10 min;进样量40μL;色谱柱柱温30℃;流动相体积流量1.0 mL/min;VWD检测器，检测波长为214 nm。

2.5 数据处理方法 采用DAS 2.0软件进行房室模型拟合并计算药物动力学参数，采用SPSS 15.0进行统计学分析。

2.6 分析方法的确证

2.6.1 方法的专属性 在上述色谱条件下，莪术二酮、吉马酮的保留时间分别为11.3 min和17.9 min，在莪术二酮和吉马酮出峰处，血浆中内源性物质不出峰，不干扰莪术二酮和吉马酮的测定结果，给药后的血浆中其他内源性杂质色谱峰与莪术二酮和吉马酮对照品色谱峰分离度均在1.5以上。见图1。

图1 血浆样品色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of rat

2.6.2 标准曲线的绘制 取大鼠空白血浆，分别加入从对照品贮备液稀释的莪术二酮和吉马酮对照品溶液，混和均匀，分别制成莪术二酮目标质量浓度 为 1.073、 2.145、 4.290、 8.580、 17.16、34.32、68.64μg/mL，吉马酮目标质量浓度为0.1972、 0.3944、 0.7888、 1.578、 3.155、6.310、12.62μg/mL的血浆样品，按2.3项下操作，取上清液40μL进样，记录色谱图，以相应待测物峰面积值(Y)对相应的对照品质量浓度(X)进行线性回归处理，得莪术二酮的标准曲线回归方程为Y=16.245x+64.196，R=0.9943，检测质量浓度线性范围为1.073～68.64μg/mL;吉马酮的标准曲线回归方程为Y=30.265x+41.504，R=0.9958，检测质量浓度线性范围为0.1972～12.62μg/mL。

2.6.3 精密度实验 取大鼠空白血浆50μL，按照“标准曲线的绘制”项下方法分别配制莪术二酮质量浓度为4.29、17.16、68.64μg/mL和吉马酮质量浓度为0.7888、3.155、12.62μg/mL的血浆样品各6份，按2.3项下操作，取上清液40μL进样，按2.4项下色谱条件进行分析，于日内和连续6 d内测定各样品，计算日内、日间精密度，结果见表1。结果表明此方法符合生物样品的测定要求，可以用于血浆中莪术二酮和吉马酮的测定。

表1 大鼠血浆样品中莪术二酮、吉马酮测定方法的精密度(n=6)Tab.1 Precision of curdione and germacrone of the assay in rat plasma(n=6)

2.6.4 稳定性考察 取大鼠空白血浆适量，按照2.3项下操作，分别配制莪术二酮质量浓度为4.29、17.16、68.64μg/mL和吉马酮质量浓度为0.7888、3.155、12.62μg/mL血浆样品各 6份，混和均匀，－20℃冷冻保存，分别进行长期稳定性、冻融稳定性和短期稳定性试验。将以上血浆样品分别于0、1、2、3、4 d取出，室温融化后按2.4项下操作，取上清液进样40μL，考察莪术二酮和吉马酮在大鼠血浆中含量测定的长期稳定性。将以上血浆样品反复冻融5次，考察冻融稳定性。将刚配制好的血浆样品溶液室温25℃放置，于0、4、8、12、16 h，按 2.4项下操作，取上清液40μL进样，考察短期稳定性。结果见表2。

表2 大鼠血浆样品中莪术二酮、吉马酮的稳定性结果(n=6)Tab.2 Stability of curdione and germacrone in rat plasma(n=6)

结果可见莪术二酮和吉马酮血浆加药样品的室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性的测定结果变化均在允许范围内(RSD＜15%)，保证了样品测定结果的可靠性。

2.6.5 提取回收率和方法回收率 取大鼠空白血浆100μL，加入不同质量浓度混合对照品，配置低、中、高3个质量浓度(莪术二酮质量浓度为4.29、17.16、68.64μg/mL和吉马酮质量浓度为0.7888、3.155、12.62μg/mL)的血浆样品各 6份，按2.3项下操作，取上清液40μL进样，按上述色谱条件分离，记录莪术二酮和吉马酮的峰面积A。另配制低、中、高质量浓度的莪术二酮和吉马酮对照品溶液各1份，使莪术二酮的质量浓度分别为4.29、17.16、68.64μg/mL，吉马酮的质量浓度分别为 0.7888、3.155、12.62μg/mL，各取40μL进样，记录莪术二酮和吉马酮的峰面积B。根据A/B×3×100%，计算提取回收率。将血浆样品测得的莪术二酮、吉马酮的峰面积A代入标准曲线回归方程，分别计算其质量浓度，以测得值与加入量的比值计算方法回收率。结果见表3。

表3 大鼠血浆样品中莪术二酮和吉马酮的提取回收率和方法回收率结果(n=6)Tab.3 Results of extraction recovery and method recovery of curdione and germacrone in rat plasma(n=6)

2.7 药动学研究 大鼠灌胃给予2 mL莪术油乳状液后(含0.3 g莪术挥发油)血浆中莪术二酮和吉马酮的血药浓度-时间曲线见图2。根据AIC值最小的原则，判定大鼠灌胃给予莪术油后，血浆中莪术二酮和吉马酮的药物浓度-时间曲线均符合权重因子为1/C2的二室模型，实验中经拟合计算得出的主要药动学参数见表4。

图2 大鼠血浆中莪术二酮、吉马酮的血药浓度-时间曲线Fig.2 Concentration-time curves of curdione and germacrone in rat plasma

3 讨论与小结

3.1 给药剂型与剂量的选择 前期实验中发现，莪术油的黏度较大，灌胃给药时无法准确定量给药，且据文献报道［5］莪术油直接灌胃给药后吸收非常缓慢，故参照文献方法加入吐温－80作乳化剂制备莪术油乳剂，质量浓度为0.15 g/mL。文献中［5］大鼠给药剂量为0.5 g莪术油，本实验发现每只大鼠(标准体质量0.25 kg)给药量为0.3 g莪术油时，便可在血浆中检测出莪术二酮和吉马酮。

表4 大鼠灌胃给予莪术油乳剂后莪术二酮、吉马酮的主要药动学参数(，n=6)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of curdione and germacrone after oral administration of ZTOE in rats(，n=6)

表4 大鼠灌胃给予莪术油乳剂后莪术二酮、吉马酮的主要药动学参数(，n=6)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of curdione and germacrone after oral administration of ZTOE in rats(，n=6)

药动学参数 单位 莪术二酮 吉马酮Tmax h 3.000 ± 0.000 3.500 ± 0.000 Cmax mg/L 34.969 ± 0.700 6.361 ± 0.300 T1/2α h 1.102 ± 0.030 1.479 ± 0.483 T1/2β h 8.417 ± 0.408 6.282 ± 1.994 V L/kg 1.295 ± 0.076 6.261 ± 1.128 CL L/h/kg 0.471 ± 0.027 1.974 ± 0.083 AUC(0-tn) mg/L*h 242.142 ± 8.146 43.472 ± 1.713 AUC(0-∞) mg/L*h 275.282 ± 16.222 46.266 ± 1.871 K10 0.365 ± 0.030 0.324 ± 0.061 K12 0.174 ± 0.020 0.092 ± 0.038 K21 0.174 ± 0.008 0.203 ± 0.063 ka 1/h 0.874 ± 0.048 0.749 ± 0.050

3.2 测定方法的确定 莪术挥发性成分的体内药动学研究方法较多，有气相色谱法［10］，毛细管气相色谱法［11］，HPLC［5］，HPLC-MS［7］等。本研究采用HPLC法对大鼠血浆中莪术二酮、吉马酮的含有量进行测定。本实验参照相关文献［12］取214 nm为检测波长，通过比较最终选择流动相为乙腈(A)-水(B)进行梯度洗脱，0～20 min为50% ～80%(A)。结果表明，所建立的HPLC法操作简单、方法灵敏、结果准确可靠，适用于莪术二酮和吉马酮在大鼠体内血药浓度的测定及药代动力学研究。

3.3 药动学结果分析 本实验表明，对正常大鼠一次性灌胃给予0.3 g莪术挥发油后，莪术二酮、吉马酮在体内均呈二室模型，其达峰时间Tmax分别为3 h和3.5 h，表明大鼠灌胃莪术油后莪术二酮和吉马酮吸收较慢。此外，莪术二酮和吉马酮的达峰浓度Cmax分别为(34.969±0.70)μg/mL和(6.577±0.52)μg/mL。两种成分的消除半衰期T1/2β莪术二酮(8.417±0.408)h，吉马酮为(6.282±1.994)h，说明莪术二酮的消除速度慢于吉马酮。由于灌胃给药可能会存在肝肠循环从而干扰消除相动力学参数的计算，因此需要进一步的肝肠药代动力学实验证明。

综上所述，本实验建立了大鼠血浆中莪术二酮、吉马酮的HPLC测定方法，该法操作简单、专属准确、灵敏可靠。研究结果为莪术的临床给药方案设计和优化提供了有价值的实验数据，为进一步研究莪术活性成分的体内药动学行为提供了重要的依据。

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