箬叶中抑菌成分的提取及抑菌试验

何 舟，陈 新，杨 桃，李 龙，胡 海，许 旭

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

箬叶为禾本科(Graminales)竹亚科(Bambusoideae Nees)箬竹属(Indocalmus)植物叶的总称，该属约含20种，均产我国［1］。箬叶在我国具有悠久的药用和食用历史，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能［2］。临床应用于治疗呼吸道感染、头痛咽痛等疾病［3］。一是抗菌及抗病毒，二是抗炎解热、抗肿瘤［4］。箬叶中含有大量的黄酮类化合物，从九十年代开始人们对黄酮类活性物质研究就开始了，主要表现为抗氧化、分离纯化等方面。近年来，国内外学着对黄酮化合物抑制微生物的研究逐步深入，最新的研究结果表明，箬叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸类化合物、葸醌类化合物、萜类内酯和生物碱等都有着较强的抑菌杀菌作用［5］。箬叶提取物对大肠杆菌、枯草牙孢杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金牙孢杆菌具有广泛的抑制作用，其抑制效果随作用时间延长和使用提取液浓度的提高而增强［6］。箬叶中有效抑菌活性成分提取具有重大意义，箬叶中有效抑菌活性成分提取物在金黄色葡萄球菌，大肠杆菌这类细菌上抑菌效果显著［7］，开发这类抑菌药物前景广大［8］。

本实验首先探讨不同提取液对箬叶抑菌活性的影响，确定采用水提取箬叶中抑菌活性成分，进而拟定箬叶水提液抑菌作用为观测指标，利用单因素和响应面实验优化提取工艺，旨在探讨该方法提取的最佳工艺，为进一步提取利用箬叶中抑菌活性成分贡献有重大价值的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

箬叶，由武汉工业学院生物与制药工程学院实验室提供

1.1.2 试剂仪器

氢氧化钠(AR)、氯化钠(AR)、冰醋酸(AR)、乙醇(AR)、石油醚(AR)、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、乙酸乙酯(AR)，牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl5.0 g/L，pH7.0—7.2;供试菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.arueus)大肠杆菌(Escherichia.coli)，由武汉工业学院生物与制药工程学院实验室提供

AL204－01型电子天平，梅特勒－托利多仪器有限公司;RE52－99型旋转蒸发仪器，上海亚荣生化仪器厂;SPX－300BSH－II型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;HQ45Z型恒温摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司;JJ－CJ－2FD型超净工作台，苏州市金净净化设备科技有限公司;752N可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同提取液制备样品方法比较

用箬叶制备水提液备用，其中一份加入醋酸另一份不作处理。用箬叶制备醇提液备用，(乙醇体积分数分别为30%，40%，50%，60%，70%)其中一份加入醋酸另一份不作处理。利用提取液进行抑菌实验，测定抑菌圈大小。由于醋酸对提取液抑菌效果具有协同作用，使抑菌效果更为明显，故设置酸抑菌对比实验。

1.2.2 箬叶水提取法的单因素试验和响应面优化试

以抑菌圈直径为评价标准，首先拟定提取温度、料液比、提取时间进行单因素试验。在单因素试验基础上进行响应面优化实验工艺参数范围，采用Box－Behnken设计方案，并进行实验数据的线性拟合和方差分析确定箬叶抑菌活性成分提取的最佳工艺。

1.2.3 样品及对照组的箬叶抑菌活性实验

将直径为6 mm的滤纸片盛于培养皿中灭菌，经高压蒸汽灭菌，121—126℃灭菌30 min后置于50℃烘箱内烘2 h，将滤纸片放入分别置不同浓度的供试样品中，浸泡30 min。对照组用无菌蒸馏水浸泡30 min。将灭过菌的镊子取滤纸圆片，无菌操作放入菌液平板上(每个皿正六边形对称放6张滤纸圆片，其中三片用蒸馏水对照)，做三次重复实验。细菌平板倒置37℃恒温培养18—24 h，测定抑菌圈直径，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 不同提取液对箬叶抑菌活性影响

准确称取箬叶200 g，置3 000 mL烧瓶中，箬叶比水为1∶10比例加入蒸馏水，60℃恒温水浴加热，备用。将滤液浓度配制成2 g/mL，其中一份加入体积比(药液:醋酸20∶1)的醋酸，另一份不作处理，醇提取方法同上，另外配制2 g/mL的醋酸溶液，结果见表1和图1。

表1 水和一定体积分数醇加酸前后抑菌效果比较

图1 水和一定体积分数醇加酸前后抑菌效果比较

从左至右依次为大肠杆菌水提液，大肠杆菌水提液加酸，金黄色葡萄球菌水提液，金黄色葡萄球菌水提液加酸。通过图1和表1可以得到，提取液加酸后抑菌效果比不作处理的显著。大肠杆菌抑菌效果普遍大于金黄色葡萄球菌，故下面抑菌实验中选择大肠杆菌为观测指标菌。

2.2 箬叶提取工艺单因素实验

2.2.1 提取温度对箬叶水提取物抑菌活性影响

图2至图4中，菱形折线代表大肠杆菌抑菌效果曲线，正方形折线代表金黄色葡萄球菌抑菌效果曲线。

由图2得到，当温度达60℃时箬叶提取物抑菌活性成分对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果都达到最强，故选择最佳提取温度为60℃。

图2 提取温度对箬叶水提取物抑菌活性影响

2.2.2 料液比对箬叶水提取物抑菌活性影响

由图3得到，随着料液比值的增加，箬叶活性物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制微慢上升后趋于平缓。为了节约成本，选择料液比1∶10(g∶mL)最佳。

图3 料液比对箬叶水提取物抑菌活性影响

2.2.3 提取时间对箬叶水提取物抑菌活性影响

由图4得到:随着提取时间的增加，箬叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果逐渐增强。提取时间增加至2.5 h后，箬叶活性物对两种菌的抑制效果趋于平衡，故选择最佳提取时间2.5 h。

图4 提取时间对箬叶水提取物抑菌活性影响

2.3 响应面优化实验设计结果

在单因素试验基础上，采用Design－Expert.v8.0.6响应面实验之中心组合实验Box－Behnken设计方案［9］。选三个因素:提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)，以抑菌圈(Y)为指标见表2、表3。并对实验数据进行线性拟合和方差分析，考察因素显著性见表4。根据回归方程，响应面曲线图，等高线图，分析各因素交互作用的显著性，得出实验结果(见图5—图7)。

对表3中数据进行多元回归拟合，得各因素与抑菌圈大小的二次多项回归方程为

表2 Box－Behnken响应面实验因素与水平

表3 Box－Behnken响应面实验

表4 拟合二次多项式模型的方差分析

由表4可以看出:抑菌效果显著性大小依次为B＞A＞C。方程复相关系数的平方R2=0.9843，说明该模型显著性好;失拟性大于0.05不显著，说明方程误差小。Radj 2=0.964 0，说明该模型能够反映96.40%响应值的变化，较好反映提取条件对抑菌效果的变化规律。

图5

图6

图7

由图5至图7可知:提取时间与液料比相互作用极为显著(P=0.0093＜0.01)，提取温度与液料比相互作用对抑菌圈影响较为显著(P=0.0339＜0.05)，提取时间与提取温度相互作用不是很显著(P=0.4561 ＞0.01)。

通过响应面优化箬叶抑菌活性成分抑菌最佳提取工艺条件:提取温度50℃，提取时间2.89 h，液料比9.44。抑菌圈预测值14.073 5 mm。对提取最佳工艺进行修正:提取温度50℃，提取时间3 h，料液比1∶10(g∶mL)，抑菌圈实际值13.873 5 mm。实际值与预测值差异较小，说明响应面模型优化设计适合箬叶抑菌活性成分提取工艺。

3 结论

本文进行不同提取液对箬叶抑菌活性影响探讨，得出结论:水提取效果优于醇提取，提取液加酸后抑菌效果比不作处理的显著，大肠杆菌抑菌效果普遍大于金黄色葡萄球菌。故后续实验选择大肠杆菌为观测指标菌。

利用抑菌实验，对箬叶抑菌活性部位水提取工艺进行优化，采用单因素及响应面优化实验得到最佳提取条件:提取温度50℃，料液比1∶10(g∶mL)，提取时间3 h。抑菌圈大小为13.8735 mm。结果表明箬叶水提取液对大肠杆菌表现出较好抑菌效果，开发箬叶中有效抑菌活性成分意义深远。

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［5］吴传茂，吴周和，曾莹.从植物中提取天然防腐荆的研究［J］.食品科学，2000(9):24－27.

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