响应面分析法优化核桃蛋白提取工艺

张继文，王丽梅，马琳，肖洁

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

核桃又名胡桃，原产于欧洲东南部、西亚等地区，我国大部分地区都有分布［1］。据《本草纲目》记述，核桃仁有“补气养血，润燥化痰，益命门，处三焦，温肺润肠，治虚寒喘咳，腰脚重疼，心腹疝痛，血痢肠风”等功效，被誉为“万岁子”、“长寿果”，在中医用广泛［2－4］。核桃蛋白是一种很好的植物蛋白，在脱脂的核桃粕中，蛋白质含量高达50%［5］。每100 g核桃可提供6.31 kcal的能量［6］。核桃蛋白质中含有18种氨基酸，其中包括多种人体必需氨基酸，尤其是精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸等含量非常高，8种必需氨基酸的含量比例合理，具有很高的使用价值和保健功能［7－8］。

本实验以浙江临安山核桃为原料，通过对提取温度、碱水提取pH值、等电点三个因素进行研究，在单因素试验的基础上通过响应曲面优化核桃蛋白提取的工艺参数，提高提取率，以期找到核桃蛋白提取最佳的的生产工艺，促进我国的核桃蛋白深加工的发展。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

临安山核桃:产自浙江省临安市，市场购买后常温密封袋保存;石油醚 分析纯;甲醇 分析纯;正己烷分析纯。

1.2 仪器与设备

TD型电子天平，余姚市金诺天平仪器有限公司产品;Cslol-1AB型电热鼓风干燥箱，重庆银河实验仪器有限公司提供;Ac220V型多振幅恒温轨道摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;旋转蒸发器，SHZD型循环水真空泵，水浴锅，巩义市予华仪器有限公司;H1650型高速台式离心机，长沙湘仪离心机设备有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃原料的预处理

将去壳后的核桃仁放入50℃的热水中，浸泡8 min，去皮，核桃仁置于55℃的烘箱中烘干，研碎成粉末［10］。采用石油醚浸泡核桃粉末并放入多振幅恒温轨道摇床振荡两小时，取出后置于旋转蒸发器中抽滤，然后烘干得到核桃粉末样品。

1.3.2 单因素实验

(1)提取温度对核桃蛋白提取率的影响 核桃蛋白的变性温度为67.05℃，所以温度设定在60℃以下［10］。

取样品2 g，加100 mL蒸馏水混匀，分别将样品加热至30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃后，再调pH 至9.0，并保持30 min，静置冷却10 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液。将上清液调至pH4.5，3 000 r/min 离心 10 min，取沉淀，干燥称重。

(2)碱提pH对核桃蛋白提取率的影响 取样品2 g，加100 mL蒸馏水混匀，将样品加热到50℃后，分别将样品用 NaOH 调 pH 至 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，保持 30 min，静置冷却 10 min，3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，调 pH4.5，3 000 r/min离心10 min，取沉淀，干燥称重。

(3)酸沉pH(等电点)对核桃蛋白提取率的影响 取样品2 g，加100 mL蒸馏水混匀，将样品加热到50℃，用NaOH溶液调pH为9.0，保持30 min，静置冷却10 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液，分别用 HCL 溶液调 pH 到 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，3 000 r/min离心10 min，取沉淀，干燥称重。

1.3.3 响应曲面分析法优化核桃蛋白提取工艺

综合单因素实验结果，确定核桃蛋白的提取温度，碱提pH值以及等电点pH，运用Design Expert 7.0软件(Stat-Ease，Inc.)，采用三因素三水平的响应曲面分析法，以核桃蛋白的提取率为响应值做响应曲面，对提取条件进行优化。

表1 Box-Benhnken实验因素与水平的选取

1.3.4 蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法，参见GB/T5009.5-2003。

1.3.5 提取率计算

2 结果与分析

2.1 温度对提取率的影响

从图1可知，随着温度的增加，核桃蛋白质的提取率逐渐增加，超过50℃之后，提取率开始呈下降趋势。温度为50℃时，核桃蛋白的提取率最高;40℃和60℃时的提取率次之。响应面分析中选取45℃，50℃，55℃为温度的3个水平。

图1 温度对提取率的影响

2.2 碱提pH值对提取率的影响

从图2可知，pH值为9.0时，核桃蛋白的提取率最高，达到43%;pH 值为8.0和10.0时的提取率次之。在实验中发现，pH值的变化会影响所提取核桃蛋白成品的颜色，而且随着pH值的增大，颜色也来越深。但在pH 值8.0－11.0范围内，颜色较浅。响应面分析中选取 8.5，9.0，9.5 为碱水提取pH值的3个水平。

图2 碱提pH对提取率的影响

2.3 等电点对提取率的影响

由图5可知，在 pH 值为4.5—5.0时，核桃蛋白的提取率的波动范围不大，其中，pH值为4.5时，核桃蛋白的提取率最高。由此可以判断，核桃蛋白等电点为4.5。响应面分析中，酸沉pH值均选择4.5。

图3 酸沉pH值(等电点)对提取率的影响

2.4 响应曲面分析法优化核桃蛋白的提取工艺

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素影响的实验结果，以碱溶pH(X1)、等电点(X2)、提取温度(X3)，核桃蛋白的提取率为响应值，进行3因素3水平的响应曲面分析试验。响应曲面分析方案及实验结果见表2。采用Design Expert 7.0软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程及方差分析

经过F检验，Prob＞F值小于0.01，说明三个因素对提取率的影响都是高度显著的，而 R2=0.987 9，说明所得的回归方程非常显著，所以回归方程能够很好的模拟真实的曲面。

为了更直观的反应三个因素间的相互作用对提取率的影响，做出两两自变量为坐标的3D图。图4为碱溶pH(X1)与等电点(X2)的交互作用对于提取率(Y)的影响，核桃蛋白提取率曲线呈现出先上升到平缓稳定再到略有下降的状态。随着pH(X1)的升高，以及等电点(X2)的延长，提取率上升。当pH、等电点分别增大到一定程度时，提取率(Y)趋于饱和，响应曲面变平缓，随后若再同时增大pH、等电点时，提取率会略有下降。因此，最佳取值点应取在最有效提取出大部分核桃蛋白，即提取率不再显著增高的坐标点处。

图4 等电点与碱溶pH的交互作用对提取率的影响

图5是温度与pH交互作用提取率影响的响应曲面等高图，图6是温度和等电点交互作用对提取率影响的响应曲面等高图，反映出的结果与图4类似，通过计算本实验的回归方程，可得到三个因素的最佳作用值。

图5 温度与pH交互作用对提取率的影响

图6 温度和等电点交互作用对提取率的影响

2.5 最佳工艺的推导及验证

利用上述的分析进行最优工艺的推导，对得到的回归方程取一阶偏导数为零得到:

联立方程(2)、(3)、(4)求解，得到 X1=0.135，X2=0.248，X3=0.0906，换算得到最佳工艺条件为pH=9.07，等电点 =4.62，温度 =50.45 ℃ 的条件下经过回归方程计算提取率为Y=44.54%。

取上述得到的工艺条件为实验条件，进行验证试验结果如表3所示。

从表中可以看出，实验值与理论值比较接近，其误差为0.8%。按照此条件进行三次提取，平均值为44.50%。因此，可知利用响应曲面分析法优化后的工艺提高了核桃蛋白的提取率，工艺参数真实可靠、具有实用价值。

表3 实验结果的验证(n=3)

3 结论

在单因素实验的基础上，通过三因素三水平的响应曲面分析法对碱溶酸沉浸提法进行工艺优化，结果表明，提取核桃蛋白的最佳工艺条件为碱水pH值9.07 ，等电点 4.62，温度 50.45 ℃，在此条件下提取率为44.50%。本实验利用响应曲面分析法来优化提取核桃蛋白质的影响因素，从而为提高核桃蛋白的提取率提供了理论依据。

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