鸭肉蛋白酶解液制备的工艺优化

褚仕超，孙 彦，刘章武

(武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉 430023)

肉类香精是一种具有动物肉类制品香味的食用香精，自20世纪80年代起在我国得到发展［1］。其广泛应用于新型加香产品中，如方便食品、调味品、肉制品及膨化休闲食品等，可提高食品品质，增添独特风味。目前，研究人员对禽肉香精［2－7］和海鲜香精［8］进行了比较广泛深入的探索，但对鸭肉香精的研究不多。因为香味独特，鸭肉作为湖北的传统特色产品在本省及全国都非常受欢迎。为满足潜在市场需求，对鸭肉蛋白进行适当的水解即可得到风味纯正、香气逼真的鸭肉香精。其中酶法水解蛋白因其独特优势，已逐渐代替传统的酸碱水解法，成为更加高效的水解方法［9－11］。为制备风味好、香型真的鸭肉香精，利用不同组合的蛋白酶对鸭肉进行水解，为后面利用美拉德反应制得香味逼真的鸭肉香精打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭肉由精武公司提供;肉类水解专用酶和风味蛋白酶均来自广西南宁东恒华道生物科技有限责任公司;氢氧化钠、盐酸、甲醛等均为分析试剂纯。

1.2 仪器与设备

FSH-2A可调高速匀浆机(金坛市医疗仪器厂);TDL-40型飞鸽离心机(上海安亭科学仪器厂);90-2型定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂);pH计(Delta320，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司);HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂);SYC15超级智能恒温水槽(巩义市英峪予华仪器厂);JBT/C-YCL400T/3(C)超声波处理机(济宁金百特公司)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量测定

凯氏定氮法［12］

1.3.2 蛋白质水解度(DH)的测定

DH=上清液中的氨基态氮/鸭肉样品中总氮量×100%

1.3.3 氨基酸氮含量的测定

双指示剂甲醛滴定法［13］.

1.3.4 酶解方法

将去皮的鸭腿肉解冻后绞碎，按1∶4的料液比将鸭肉与蒸馏水匀浆，然后通过超声波预处理后［14－15］，调节至特定 pH 值，将样品放入适当温度的恒温水浴锅中加热，再加入蛋白水解酶酶解适当时间。最后将酶解液在90℃条件下灭酶10 min，然后离心并取上清液，静置至室温后测其水解度［16］。

1.3.5 酶解的单因素试验

为选定酶解过程中的最适工艺条件，选取不同的复合酶酶比、加酶量、水解时间、初始pH值、水解温度等5个因素来进行单因素试验。

1.3.6 酶解的正交试验

根据单因素试验结果，选用复合酶酶比、加酶量、水解时间、初始pH值、水解温度等5个因素中的合适参数进行五因素四水平正交试验，从而确定最优酶解条件。正交试验的各因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 最佳复合酶比的确定

肉类水解专用酶与风味蛋白酶的比例不同对酶解反应会有影响。选定酶解条件为:pH7.5，温度55℃，加酶量0.3%(W/W)，在肉类水解专用酶:风味蛋白酶为 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 的条件下，将鸭肉浆水解4h后，升温灭酶，并测定其水解度。实验结果见图1。

图1 不同酶比对水解的影响

由图1可知，不同的酶比的酶解度也不同。酶解度与酶比之间的关联呈先升后降趋势，当肉类水解专用酶∶风味酶为2∶1时，酶解度最高，达到34.41%。

2.1.2 最佳加酶量的确定

选定酶解条件为:pH 7.5，温度55℃，酶比为2∶1，分别在加酶量为 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%(W/W)的条件下，对鸭肉浆水解4 h，酶解结束后升温灭酶，并测定其水解度。实验结果见图2。

图2 不同加酶量对水解度的影响

由图2可知，加酶量的不同对酶解度的影响呈现出先上升后趋于平衡的趋势。当加酶量小于0.3%时，加酶量增加，水解度增大，而当加酶量大于0.3%时，水解度基本上没什么变化。由于加酶量在0.3%时所得水解液颜色质地清亮，风味比较好。所以从经济成本和风味方面两方面考虑，确定加酶量为 0.3%。

2.1.3 水解时间的确定

选定酶解条件为:温度55℃，pH7.5，加酶量为0.3%(W/W)，肉类水解专用酶∶风味蛋白酶 =2∶1，对鸭肉浆水解8 h，每隔1 h取样灭酶，并测定其水解度。实验结果如图3。

从图3可知，水解时间增加，鸭肉蛋白的水解度也增加。在反应的前4个小时，水解度增加得比较快，4个小时后水解度变化趋缓。这主要是由于刚加入酶时，底物浓度较高，反应速率随着酶的不断加入而变快。当鸭肉蛋白质底物逐渐被酶解后，底物浓度下降，酶解速率也随之下降。同时，随着反应时间越来越长，温度越来越高，也可使部分酶发生变性，导致酶解后段速度下降。而且实验表明，当水解时间超过4 h后，水解液风味开始变差，所以综合考虑后选定鸭肉水解最适宜时间为4 h。

图3 不同水解时间对水解度的影响

2.1.4 最佳酶解温度的确定

温度影响酶的活力，同时也会影响酶解过程中轻度发生的美拉德反应，从而对酶解液的风味和色泽产生影响。选定酶解条件为:pH7.5，加酶量为0.3%(W/W)，肉类水解专用酶∶风味酶=2∶1，分别在45℃、50℃、55℃、60℃下，对鸭肉浆水解4h，酶解后升高温度对其灭酶，并测定其水解度。其结果见图4。

图4 不同水解温度对水解度的影响

由图4可知，选择合适的酶解温度对酶解反应的速率具有重要的影响，且水解液的风味和色泽也会受温度的影响。当温度低于50℃时，随着反应温度的增加，水解度也逐步上升，达到33.20%。当温度超过50℃时，酶解度也渐渐降低。这主要是由于酶具有最适反应温度，在一定的温度范围内，温度升高，酶活力增大，酶促反应速率加快。当酶超过其适应温度范围变性后，酶的活性便会降低。因此，确定酶解温度为50℃。

2.1.5 水解最佳pH的确定

选定酶解条件为:温度55℃，加酶量为0.3%(W/W)，肉类水解专用酶与风味酶酶比为2∶1，分别在 pH 为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的条件下，对鸭肉浆水解4 h，酶解后迅速升温灭酶，并测定其水解度。实验结果见图5。

由图5可见，不同的pH下，酶解反应的速度也会不同，pH偏高或偏低都不利于酶解反应的进行。因为酶有最适酸碱范围，过酸或过碱都会影响到酶的活性和稳定性，从而影响酶解反应的速度，使得酶解反应的水解度下降。因此，确定酶解pH为7.5。

图5 不同pH对水解度的影响

2.2 正交实验结果

为更全面的照顾到各单因素对酶解效果的影响，实验将水解度作为优化指标，对复合酶的酶比、加酶量、水解温度、水解时间和pH等5个因素进行优化设计。表1为酶解实验设计因素与水平，表2为酶解实验正交设计方案及实验结果。

表1 酶解的因素和水平

表2 酶解的正交实验结果

2.3 最佳酶解条件的确定

对正交表中的数据进行极差分析，可以看出，各单因素对水解度的影响从大到小分别为:pH、水解温度、酶比、水解时间、加酶量。而最佳的试验组合为:酶比2∶1，水解时间5 h，水解温度50℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。但该组合并没有出现在正交实验中，通过补充该组实验可知，在所得水解度为34.1%时，最佳水解条件为:酶比2∶1，水解时间5 h，水解温度50 ℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。

3 结论

在鸭肉酶解的初段，随着时间的增加，水解度也快速的增长，而到了酶解后期，水解度随时间的增加就会增长得比较缓慢。对水解度影响比较明显的还有水解温度和起始pH，温度过高或者过低，以及水解环境过酸或者过碱都会影响酶的活性，从而导致水解度相对比较低。达到一定数值的加酶量，如果继续加大加酶量，水解度上升便会变得缓慢。其主要原因在于，在一定底物浓度下，加酶量较低时，酶可能已经饱和，于是加酶量越大，酶解速率就会越高。进一步增加加酶量，酶的浓度在反应体系中升高，两种酶之间就会产生相互抑制，水解度的变化就不会太明显。此外，试验还研究了不同配比下肉类水解专用酶和风味蛋白酶组成的复合酶对水解度的影响，结果表明，不同比例的复合酶，水解度也会有差异。

正交实验及其分析对复合蛋白酶水解工艺所进行的优化，可以得出酶解的最佳工艺条件为:酶解时间5 h;酶解温度50℃;酶解起始pH 7.5;酶比为肉类水解专用酶∶风味蛋白酶=2∶1;加酶量0.3%(W/W)。而通过研究人员在其他肉类香精方面的研究可知，肉类蛋白酶解液的水解度在30%左右时进行Maillard反应便于形成较好的肉类香气和风味。［17－18］

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