菌核侧耳黄酮的超声法提取及体外抗氧化性能

谢宗波， 陈 赟， 乐长高

(1.东华理工大学化学生物与材料科学学院，江西南昌 330013;2.江苏省地质矿产局第六地质大队，江苏连云港 222023)

菌核侧耳(Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing)，又名核侧耳、虎奶菇等，属担子菌纲伞菌目侧耳科，系木腐生大型真菌(余志坚等，2010)。菌核侧耳富含蛋白质、氨基酸、膳食纤维、维生素、矿物质等活性成分，具有治疗痢疾、哮喘、冠心病、高血压、肿瘤等功效，是一种极具开发前景的“药食同源”菌(包水明等，2007;韩建东等，2011;张越等，2012;冯雪风等，2007)。过去10年，有不少关于菌核侧耳的研究报道，如包水明等(2007)，余志坚等(2005)，阮瑞国(2002)，林戎斌等(2001)对其栽培技术进行了研究;余志坚等(2010)，冯雪风等(2007)，曾小龙等(2007)对其活性成分进行了分析;也有不少关于菌核侧耳液体发酵的报道(李荣同等，2008;吴锦忠等，2005)。这些研究为菌核侧耳的开发利用提供了理论依据。

黄酮是一类广泛存在于植物及微生物中的次生代谢产物，具有抗氧化、抗病毒、降血脂、防衰老及抗癌等功效，并且已有大量关于黄酮的研究(刘峙嵘等，2005;李芳涛等，2009;黄琼等，2012;郑朝华等，2012;谢宗波等，2009;陈中胜等，2002)，但还未见菌核侧耳黄酮的相关报道。笔者探索了超声法提取菌核侧耳黄酮的工艺条件，并对其纯化方法和抗氧化性能进行了初步的研究，该研究进一步丰富了菌核侧耳的研究内容，为促进菌核侧耳的开发及推广应用具有重要意义。

1 实验材料

AB-8树脂(南开大学化工厂)，芦丁标准品(生化试剂，上海试剂一厂);可见分光光度计(VIS-723G型，上海精密科学仪器有限公司)，台式超声波清洗器(KQ-250DB型，巩义市予华仪器有限责任公司);菌核侧耳子实体和菌丝体由东华理工大学生物系食用菌研究中心提供，60℃干燥后粉碎备用;其它试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 总黄酮的提取

称取菌核侧耳子实体(或菌丝体)粉末0.5 g于圆底烧瓶中，加入适量的80%乙醇溶液，安装回流装置，在一定温度下超声提取30 min，提取液冷却至室温后，抽滤，滤液用80%乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中备用。

2.2 黄酮的测定

(1)芦丁标准溶液的配置。称取芦丁标准品(已80℃真空干燥至恒重)15.0 mg，用80%乙醇配成0.30 mg/mL的标准溶液。

(2)最大吸收波长及回归方程。根据谢宗波等(2009)确定黄酮的最佳测定波长，并建立回归方程。

(3)黄酮的测定。取菌核侧耳黄酮提取液2 mL，根据谢宗波等(2009)测吸光度，并根据回归方程计算黄酮提取率。

2.3 树脂吸附技术纯化菌核侧耳黄酮

许剑平等(2012)对AB-8大孔吸附树脂进行预处理。称取处理后的树脂1.00 g于锥形瓶中，向其中加入黄酮提取液25 mL，25℃震荡吸附2 h;过滤，用滤纸吸干水分后，将负载树脂置于适量的95%的乙醇溶液中，30℃震荡洗脱2 h，按实验方法测定滤液中的黄酮含量，并根据下列公式计算树脂的吸附量和解吸率。

吸附量(mg/g)=(吸附前黄酮总量－吸附后黄酮总量)/树脂的质量

解吸率(%)=洗脱液中黄酮总量/总吸附量×100

2.4 颜色实验

利用纯化后黄酮的颜色反应实验，鉴别菌核侧耳黄酮。

(1)盐酸-镁粉反应。向2 mL黄酮提取液中加适量镁粉，再滴加浓盐酸数滴，1～2 min内观察颜色变化。

(2)FeC13反应。向2 mL黄酮提取液中滴加1%FeC13溶液数滴，混匀，观察现象。

(3)AlCl3反应。滴一滴黄酮提取液于滤纸上，干燥后喷l%AlCl3溶液，烘干后在紫外灯下观察荧光。

(4)碱性试剂反应。滴一滴黄酮提取液于滤纸上，干燥后喷4%NaOH溶液，烘干后观察颜色变化。

(5)浓硫酸反应。取2 mL黄酮提取液于试管中，加入浓硫酸数滴，混匀，滴在滤纸上，吹干后观察现象。

2.5 抗氧化试验

(1)测定原理。通过Fenton反应产生的羟基自由基(·OH)，能够氧化水杨酸生成2，3-二羟基苯甲酸，该产物在510 nm处有特征吸收，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物的量，来确定菌核侧耳黄酮对·OH的清除率。

(2)测试方法。在25 mL容量瓶中依次加入3 mL 2 mmol/L 的 FeSO4、3 mL l mmol/L 的 H2O2，混匀后加入6 mmol/L水杨酸3 mL，摇匀，于37℃水浴中处理15 min，蒸馏水定容，在510 nm处测吸光度A0(蒸馏水做参比)。在25 mL容量瓶中加入一定量经纯化的黄酮提取液，再依次加入3 mL 2 mmol/L 的 FeSO4、3 mL l mmol/L 的 H2O2，混匀后加入6 mmol/L水杨酸3 mL，摇匀，于37℃水浴中处理15 min，蒸馏水定容，在510 nm处测吸光度A(蒸馏水做参比)。按下式计算黄酮提取液对·OH的清除率:

清除率%=(A0-A)/A0×100

3 结果与讨论

3.1 吸收光谱及回归方程

由芦丁标准溶液、菌核侧耳黄酮提取液吸收光谱数据确定λmax=512 nm;由标准曲线数据得回归方程为:c=98A+0.90，R=0.999 5。

3.2 菌核侧耳总黄酮提取工艺的优化

在比较了索氏提取、超声波及微波的提取效果后，决定以乙醇水溶液为提取剂，选择超声技术进行菌核侧耳子实体总黄酮的提取;并通过单因素实验探索了乙醇浓度、时间、温度、料液比等因素对提取效果的影响。

(1)时间对提取率的影响。以80%乙醇为提取剂，在料液比为1∶30的条件下，60℃超声提取一定时间，所得结果如表1所示。由表1数据可知，提取30 min可取得最佳的提取效果，随提取时间进一步延长，黄酮得率反而有所降低，可能是因为长时间的超声处理破坏了部分黄酮类物质的结构。因此选择30 min作为最佳提取时间。

表1 提取时间对黄酮提取率的影响Table 1 Effect of extracting time on the extraction rate of flavones

(2)乙醇浓度对提取率的影响。以50%～90%的乙醇水溶液做提取剂，料液比为1∶30，60℃条件下超声提取30 min，所得结果见表2;由表2可知，乙醇浓度对黄酮提取率有较明显的影响，以80%的乙醇水溶液做提取剂效果最好，因此选择80%乙醇溶液用于后续研究。

接下来考察了温度和料液比对黄酮提取效果的影响，实验结果表明，70℃和料液比1∶30(g/mL)条件下黄酮得率最高。综上所述，菌核侧耳子实体总黄酮提取的最佳条件为:以80%乙醇水溶液为提取剂，料液比为1∶30，70℃条件下超声提取30 min，黄酮得率为0.20%。而在此条件下，菌丝体的黄酮得率可达0.36%，可见菌核侧耳菌丝体的黄酮含量高于子实体。

表2 乙醇浓度对提取率的影响Table 2 Effect of alcohol concentration on the extraction rate

3.3 大孔树脂对黄酮的静态吸附效果

AB-8大孔树脂对菌核侧耳黄酮的吸附量为5.2 mg/g，解吸率为 92%。

3.4 颜色反应实验

菌核侧耳黄酮提取液的颜色反应结果如表3所示，由颜色反应结果可进一步证实菌核侧耳子实体和菌丝体中黄酮类化合物的存在，但黄酮类型及结构有待进一步研究确定。

表3 颜色反应结果Table 3 The results of color reactions

3.5 体外抗氧化实验

实验结果表明，在添加黄酮0.04～0.2 mg/mL浓度范围内，随黄酮加入量的增加，其清除·OH的能力不断增强，当黄酮浓度为0.2 mg/mL时，有50%的自由基可被清除。可见，菌核侧耳黄酮的体外抗氧化能力较强。

4 结论

⑴本研究首次报道了菌核侧耳黄酮类化合物的提取工艺。

⑵实验结果表明，菌核侧耳菌丝体、子实体中都存在黄酮类化合物，菌丝体中黄酮含量高于子实体。

⑶菌核侧耳黄酮对·OH有较强的清除能力。

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