乌鸡蛋品质的电喷雾萃取电离质谱法研究

欧阳永中， 李 操， 姜翠翠， 张兴磊， 肖赛金， 朱志强

(东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室，江西南昌 330013)

鸡蛋由于含有丰富的优质蛋白质、维生素、矿质元素等营养成分，通常是人们滋补营养的首选。与普通鸡蛋相比，脂肪含量相对较低的乌鸡蛋，更加深受广大消费者的欢迎(程瑛琨等，2005)。通过饲料配比来调控鸡蛋的营养成分是目前养殖业常用的技术手段(吴孝兵等，2001;李瑞，2007)。投喂含有中药的饲料往往会改变鸡蛋的品质(牛丽凤等，2010)。葛根含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等有效药用成分，具有降血压、止泻、抗心律失常等功效。人参含有多种人参皂甙，具有抗肿瘤、抗衰老、增强体力等功效。研究表明，饲喂葛根对母鸡的血脂水平和鸡蛋胆固醇含量有影响(Kanpai et al.，2004;Martinez et al.，2001);饲喂人参可以提高鸡蛋品质和产蛋量，降低鸡蛋胆固醇的含量，提高鸡蛋黄不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比例(Ao et al.，2011;Yan et al.，2011)。

鸡蛋清和蛋黄粘稠，很难直接进行分析。传统分析鸡蛋中营养成分的方法，都需要对样品进行提取和分离，操作复杂，耗时长。质谱法因为其灵敏度高，特异性强，广泛用于食品分析、无机元素检测(肖爱芳等，2012)等领域。新型常温常压离子源质谱分析技术，由于具有无需样品预处理或很少样品制备、在大气压下操作等优点，越来越受到人们的关注(杨水平等，2012)。中性解吸电喷雾萃取电离质谱技术(Neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry，ND-EESI-MS)，是一种能直接对粘稠物样品进行快速分析的新兴离子化技术，已被用于香水(Chingin et al.，2009)、啤酒(Zhu et al.，2010)、蜂蜜(Law et al.，2009a)、食用油(Law et al.，2009b)、牙膏(Ding et al.，2009)等粘稠样品的直接分析(Li et al.，2011)。本文以不同配比的饲料饲喂的乌鸡蛋为研究对象，通过获得不同乌鸡蛋样品的ND-EESI-MS指纹谱图，结合主成分分析方法(PCA)(张建喜等，2011)，研究投喂中药饲料对乌鸡蛋品质的影响。初步研究表明，本方法可以从分子水平观察饲料对鸡蛋品质的微小影响，这将为实时监控养殖过程提供技术思路。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

LTQ-XL型线性离子阱质谱仪(美国Finnigan公司);Xcalibur数据处理系统(美国 Finnigan公司);中性解吸电喷雾萃取离子源(ND-EESI)(实验室自制)。

甲醇(色谱醇，美国Fisher有限公司);乙酸(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)。四种乌鸡蛋样品(江西南丰某养殖场提供)，其中玉米饲喂乌鸡蛋是用玉米饲喂的乌鸡蛋，加有人参饲喂乌鸡蛋、加有葛根饲喂乌鸡蛋、普通乌鸡蛋的基础饲料是玉米-大豆饼粕，人参饲喂和葛根饲喂乌鸡蛋是在基础饲料中分别加有人参须根和葛根。

1.2 实验条件

设置EESI-MS为正离子检测模式，质量扫描范围为100～600 Da，喷雾电压为1.0 kV，喷雾气体压力为:1.4 MPa，喷雾溶剂流速为 5 μL/min，喷雾溶剂为甲醇/水/乙酸溶液(50∶48∶2，v∶v∶v)，中性解吸气体(氮气)气压为0.2 MPa。离子传输管温度为275℃。其他条件由仪器自动优化。

1.3 实验方法

取四种新鲜乌鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开。分别取2 mL鸡蛋清、鸡蛋黄样品，放置于10 mL容量瓶中，直接进行质谱分析。每个样品重复测定10次，为了防止交叉污染，测定完每个样品后用甲醇水溶液对样品管道进行清洗。获得的ND-EESI质谱图，用Xcalibur数据处理系统导入到Excel，以质荷比和质谱指纹谱图的强度为变量，导入到Matlab进行PCA分析。

2 结果与讨论

2.1 乌鸡蛋样品的EESI-MS指纹图谱

在优化的实验条件下，无需任何预处理过程，直接对4种乌鸡蛋样品进行分析，把正离子模式下获得的4种乌鸡蛋样品的全扫描一级质谱作为指纹谱图。4种乌鸡蛋清样品和蛋黄样品的指纹谱图如图1和图2所示，具有显著信号强度的质量范围为m/z 120～300。因为鸡蛋样品具有较高的粘性，样品中的大分子物质难以被解吸出来，所以质量范围大于m/z 400的离子信号较少。鸡蛋清样品都具有明显的 m/z 144，164，196，236，250，269，293，391信号，而鸡蛋黄样品除了具有上述较强的信号外，还具有明显的m/z 437信号，而且m/z 144的相对信号强度要高于鸡蛋清样品中的强度。玉米饲喂的鸡蛋样品的上述离子的信号都明显要弱于其它饲料饲喂的鸡蛋样品的信号。这可能是因为以玉米和大豆饼粕为基础饲料的鸡蛋样品，大豆饼粕中的蛋白质和营养成分要高于玉米中的营养成分。四种乌鸡蛋样品的指纹谱图基本相似，但是不同饲料饲喂的鸡蛋样品各离子信号相对强度不一样，表明电喷雾萃取电离源对鸡蛋这种粘稠样品具有很好的离子化效果。

图1 不同饲料饲喂的乌鸡蛋清样品的一级质谱图Fig.1 The EESI full scan mass spectra of dark egg white with different feed additives

图2 不同饲料饲喂的鸡蛋黄样品的一级质谱图Fig.2 The EESI full scan mass spectra of dark egg yolk with different feed additives

2.2 质谱信号的主成分分析

主成分分析方法(PCA)是一种能够把多个变量划为少数几个综合指标的一种统计分析方法(Jia et al.，2010;Wu et al.，2009;Zhang et al.，2010)。在本文中，利用该方法，通过对4种乌鸡蛋清和蛋黄共80份样品的一级质谱指纹谱数据进行处理和分析，对不同饲料饲喂的乌鸡蛋样品进行了区分和检测。图3给出了鸡蛋清和鸡蛋黄样品的ND-EESI-MS指纹谱图数据的PCA分析结果。

图3 四种鸡蛋样品的PCA得分图Fig.3 3D plot of PCA score results for 5 different kinds of dark egg using the EESI full scan mass spectra

如图3所示，对于鸡蛋清样品，选择PC1，PC2，PC3前三个主成分用于构建模型，变量的百分数分别为64.13%，12.09%，6.18%，其中 PC1 描述了数据集合中最大变量的方向。在PC2方向上能将玉米饲喂的鸡蛋清样品和其它的样品区分开来，并且其它三种鸡蛋清样品相对集中在一个区域。由于玉米饲喂鸡蛋的基础饲料为玉米，而其它三种鸡蛋样品的基础饲料都是玉米-饼粕(Swennen et al.，2004)，表明玉米饲喂和玉米-饼粕饲喂的蛋清样品不一样。

对于鸡蛋黄样品，同样的选择 PC1，PC2，PC3前三个主成分用于构建模型，变量的百分数分别为26.61%，18.43%，11.61%。在 PC1 方向上，玉米饲喂的鸡蛋样品和其它三个样品能够区分开来，其它的三个样品也相对集中在一个区域。而在PC2方向上，四种鸡蛋黄样品都能非常好的区分开来。添加有人参和葛根中药饲喂的鸡蛋样品能和其它样品也能区分开来，表明添加中药饲料对鸡蛋黄的营养成分存在一定的影响。

根据PCA分析结果，可以观察到投喂不同中药饲料对乌鸡蛋黄的影响，但是不能观察到对鸡蛋清成份的影响。主要可能有以下两种原因:一是蛋清样品和蛋黄样品成分差异。鸡蛋清的成分比较单一，主要有蛋白质、水分和很少量的脂肪，而蛋黄的成分复杂，除了蛋白质外还含有多种矿质元素、维生素、胆固醇等多种营养成分，而且脂肪含量比蛋清中的含量要高的多，饲喂葛根和人参对胆固醇影响较大(Kanpai et al.，2004;Jang et al.，2007)。鸡蛋黄样品的成分更为复杂，更容易受到加有中药饲料的影响。二是蛋清和蛋黄在母鸡体内的形成时间不同。在鸡蛋形成过程中，卵子经9～10 d成熟后，排出卵泡到达蛋白分泌部，在蛋白分泌部停留3 h包上蛋白，包上蛋白的卵在子宫内渗入子宫液、包上蛋壳。在整个过程中蛋黄在体内停留的时间要长，受到影响的时间长。因此，投喂加有中药的饲料对鸡蛋品质的影响在蛋黄品质上更容易表现出来。

2.3 分析速度和精确度

图4是检测加有葛根饲喂鸡蛋清样品的离子流图，11次进样单个样品的分析时间在3 min内，表明ND-EESI-MS的检测速度快，适合大批量样品的高通量快速分析。玉米饲喂的乌鸡蛋、加有葛根饲喂乌鸡蛋、普通乌鸡蛋样品、加有人参饲喂乌鸡蛋的10次进样的相对标准偏差(RSD)分别为:6.0%，8.6%，10.1%，8.2%，说明 ND-EESI-MS 方法的精确度高，适于粘稠的鸡蛋样品的快速分析。加有玉米饲喂的乌鸡蛋样品精确度最高，可能是因为饲料成分单一。

3 结论

图4 添加葛根饲喂的乌鸡蛋清样品的离子流图Fig.4 The ion current of dark egg white with the feed additives of root of kudzuvine

采用ND-EESI-MS技术与PCA相结合的方法，在无需样品预处理的前提下，实现了对不同饲料配比饲喂的鸡蛋样品的直接分析。由于主成分分析方法能依据成分对分类贡献的大小进行数据提取，其优点就是能对数据的微小差异进行放大和可视化，肉眼下差异很小的数据，可能在成分贡献上很明显，通过PCA分析，能很好进行判别分类。实验证明，ND-EESI-MS结合PCA的方法可以区分不同饲料饲喂的鸡蛋，能够观察到中药饲喂对乌鸡蛋黄的影响，是一种强大的分析方法。本论文的研究扩大了ND-EESI-MS用于粘稠样品分析的应用范围，也为研究饲料对鸡蛋品质的影响提供技术思路。

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