芹菜籽中黄酮成分的提取纯化及LC-MS检测

姜笑寒 孟 青 刘莉兰 刘红梅

1.广东省食品药品职业技术学校，广东广州 510663；2.广东药学院 中心实验室，广东广州 510224

旱芹（Apium Graveolens，celery）为伞形科一年生或二年生草本植物，异名香芹、药芹等[1]。芹菜籽为伞形科植物旱芹Apium graveoleus L.var.dulce DC.的干燥成熟果实。目前研究表明芹菜籽具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血压等多种药理活性[2]。芹菜籽主要含有挥发油成分、苯酞类衍生物、香豆精类成分、黄酮及其甙类成分[3]。其中黄酮类成分主要有3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙[4]。本试实验采用醇提取的方法对去油后芹菜籽中的黄酮成分进行提取，大孔树脂和聚酰胺柱分离纯化提取物，得到三个含黄酮成分的洗脱液，采用LC-MS法对其进行了检测，推测40%乙醇洗脱液含有的主要成分为木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器

提取罐（弘荃机械企业有限公司）；KQ-400DB型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；双口4列电热恒温水浴锅（江西新建医疗器械厂）；电子天平（sartotius德国产）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；DRT-SX型恒温电热套（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52旋转式蒸发器（上海亚荣深化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Waters 2695－2487 HPLC（Waters公司）；LCQ DECA XP液质联用仪（美国Thremo公司）。

1.2 试剂与药材

乙醇（天津富宇精细化工有限公司）；甲酸（广州市东红化工厂）；磷酸（色谱醇）（天津市科密欧化学试剂开发中心）；甲醇（色谱醇）、乙腈（色谱醇），（Tedia Company Inc.USA）；蒸馏水、二次去离子水（实验室自制）；大孔吸附树脂D-16（中国沧州远威化工有限公司）；80～100目聚酰胺树脂（浙江台州路桥四甲生化塑料厂）；芹菜籽（广东澄海明丰种子有限公司）。

2 方法与结果

2.1 制备芹菜籽黄酮

超临界萃取后的芹菜籽，取5 kg，加80%乙醇于提取罐中80℃回流提取3次，每次加80%乙醇10倍量，提取1 h。合并三次提取液，提取液旋转蒸发，回收乙醇，浓缩液于80℃水浴上挥干，真空干燥，得到粗提物，出膏率为14.6%。

2.2 大孔吸附树脂和聚酰胺树脂纯化[5-6]

填装大孔树脂 D-16柱子，活化处理好后，湿法上样粗提物，依次用水，10%乙醇，20%乙醇洗脱，40%乙醇，60%乙醇，95%乙醇洗脱完全，收集各洗脱液，旋转蒸发，回收乙醇，浓缩液于80℃水浴上挥干，真空干燥，得到初级纯化部分。填装聚酰胺柱，处理后取40%乙醇、60%乙醇洗脱液的初级纯化部分，拌样上聚酰胺柱，依次用水，40%乙醇洗脱，收40%洗脱液，旋转蒸发，浓缩液于80℃水浴上挥干，真空干燥，得到纯化部分。

2.3 LC检测

2.3.1 液相色谱条件 色谱柱为：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱温30℃；流动相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；检测波长：340 nm；记录时间：45 min。

2.3.2 检测 将纯化后的提取物用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，过0.2微孔滤膜后LC分析，得到纯化后的芹菜籽黄酮色谱图（图1）。

2.4 LC．MS检测

2.4.1 色谱条件 色谱柱为：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱温30℃；流动相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；检测波长：340 nm；记录时间：45 min。

2.4.2 质谱条件 离子化方式ESI（负离子方式）；扫描范围：m/z200～800；干燥气流10 mL/min；干燥器温度：350℃；雾化气压：310kPa；毛细管电压3500V；碎裂器电压：70V。

2.4.3 检测 对纯化后的芹菜籽黄酮处理（处理方法同2.3.2），进行LC－MS分析，并对 40%乙醇洗脱部分1，2，3峰进行了成分推测（表1）。

3 讨论

①考察提取方法时，根据文献[7-8]先采用了单因素实验确定了乙醇浓度和提取温度，然后通过正交实验考察提取时间、提取次数和料液比对黄酮提取率的影响。确定提取工艺即十倍溶剂量提取三次，每次提取3 h。考虑到时间影响因素对黄酮提取率最弱，再加上经济因素，最终确定提取工艺：80%乙醇溶液，80℃的条件下，以10倍溶剂量，提取3次，每次1 h。

②采用 LC－MS分析时，因为黄酮结构中含有较多的酚羟基，呈现弱酸性，易失去H，所 以选取了电喷雾负离子模式（ESI），形成 [M－H]－离子，通过碎片及分子量初步推断，三类黄酮苷类化合物所带糖基基本一致，均为一个木糖和一个葡萄糖。结果显示（见表1）：保留时间为27.60 min的化合物，其[M—H]一质荷比（m/e）为579，有285和447碎片峰，推测其为木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙；保留时间为46.1 min的化合物，其[M－H]－质荷比（m/e）为564，有431和269碎片峰，推测其为芹菜甙；保留时间为53.7 min的化合物，其[M－H]－质荷比（m/e）为594，有299和461碎片峰，推测其为3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

图1 纯化后的芹菜籽黄酮色谱图

表1 40%乙醇洗脱部分 1，2，3峰成分推测

4 结论

本实验采用醇提法提取去油后芹菜籽中的黄酮成分，大孔树脂和聚酰胺进行分离纯化 ，液相色谱．质谱联用法检测到黄酮成分主要在40%乙醇洗脱部分，并对40%乙醇洗 脱部分成分进行了推测，推测其含有的主要成分为木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。结果说明此提取纯化方法具有可行性。

[1] 刘咏松.芹菜的本草研究及功用[J].四川中医，2004，22（7）：25-26.

[2] 王文宝，马华夏，宋春梅.芹菜籽化学成分及药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2012，33（1）：49-51.

[3] 吕金良，牟新利，王武宝，等.近年来维药芹菜籽挥发油化学成分研究[J].时珍国医国药，2006，17（1）：6-7.

[4] 上海中医药大学.中药大辞典（上）[M].2版.上海：上海科技出版社，1997.

[5] 谢远红.大孔吸附树脂纯化芹菜黄酮的研究[J].广东化工，2012，39（5）：30-31.

[6] 严志慧，陈亮，罗军武，等.聚酰胺树脂分离纯化芹菜黄酮的工艺研究[J].湖南农业科学，2009（1）：85-88.

[7] 张洪杰，李小吉.芹菜叶中黄酮类化合物的提取浴测定[J].广东化工，2011，38（1）：201-203.

[8] 谢远红.芹菜总黄酮提取工艺研究[J].江苏农业科学，2012，40（9）：256-258.