病毒上清液促进体外培养INS－1细胞系胰岛素分泌

那日苏，马 聪，程园园，郑旭磊，刘巧蕊

(上海市徐汇区中心医院内分泌科，上海200031)

信号传导与转录激活因子(signal transducer and activitor of transcrrption，STATs)是一类通过酪氨酸磷酸化激活的转录因子家族。STAT5是这一家族的重要成员，有STAT5A和STAT5B两种异构体，两者具有高度同源性，它们可以在接受生长激素、催乳素、干扰素以及促红细胞生成素等多种激素或细胞因子刺激后，通过酪氨酸磷酸化偶联形成二聚体，获得进入细胞核的能力，影响目的基因的转录，从而广泛参与细胞的增殖和分化，调节细胞的凋亡。由生长激素及催乳素介导的STAT5信号通路是胰腺β细胞中主要的信号传导通路［1］。本研究拟利用反转录病毒介导的持续激活的STAT5A基因感染胰腺INS-1细胞来观察STAT5的活性对INS-1细胞增殖及其分泌胰岛素功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料:INS-1细胞及293T细胞(上海细胞库);胰岛素放免试剂盒(中国原子能研究所);FuGENE6试剂盒(Roche公司);胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI1640培养液和琼脂糖(GibcoBRL公司);蛋白酶K、RNase及四氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)(Sigma公司);磷酸化 stat5a抗体及actin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 病毒上清液制备:反转录病毒载体介导的MSCV-EGFPSTAT5ADeltaN(R20)，即小鼠stat5a cDNA的1-136位氨基酸被剪切后获得的具有持续激活功能的STAT5A，以及反转录病毒载体MSCV-EGFP(EGFP)(Dr．Moriggl所赠)。将相同剂量的包装质粒DNA及R20或EGFP质粒DNA混合后，按照FuGENE6试剂盒内的操作手册转染293T细胞，添加含10%胎牛血清的DMEM培养液3 mL，72 h后收获病毒上清。

1.3 病毒感染INS-1细胞:接种相同数目的INS-1细胞，分为EGFP对照组及R20即STAT5活性增强组。用先前制备好的病毒上清对应各组进行感染。

1.4 Western blot:两组细胞被感染72 h后提取蛋白，BAC法测定蛋白浓度，常规Western blot操作。一抗:小鼠抗兔磷酸化STAT5A多克隆一抗，空白对照用小鼠抗小鼠actin单克隆一抗。获得图像后用quantity one软件进行分析，测定各条带吸光度值，以磷酸化STAT5A条带吸光度值/actin条带吸光度值表示磷酸化STAT5A相对表达强度。

1.5 MTT实验:取两组感染72 h后的INS-1细胞，按每孔约3×104接种于6孔培养板中，每组设定3复孔，待细胞贴壁后吸去原有RPMI1640培养液，换为含10%胎牛血清的DMEM培养液。在48 h时用MTT法检测细胞增殖情况。以490 nm为检测波长，测定每孔的吸光度值(A值)。

1.6 胰岛素水平测定:将被EGFP及R20病毒上清感染后的INS-1细胞各分成3组分别置于葡萄糖浓度分为0、5.6、11.1及33.3 mmol/L的培养液中培养刺激4 h后按照试剂盒说明书操作测定胰岛素水平。

2 结果

2.1 Western blot检测磷酸化stat5a的表达:被R20病毒上清感染后的INS-1细胞有磷酸化STAT5A的表达，而EGFP感染的对照组未测出(图1)。

图1 被MSCV-EGFP及MSCV-EGFP-R20病毒上清感染后的INS-1细胞中磷酸化STAT5A的蛋白表达Fig 1 Phospho-STAT5A protein expression in INS-1 cells infected by MSCV-EGFP-R20 compared with MSCV-EGFP

表1 不同浓度葡萄糖刺激4h后各组INS－1的胰岛素分泌Table 1 Insulin releasing of INS-1 cells 4 hours after stimulated by different glucose concentration(±s，ng/L，n=3)

表1 不同浓度葡萄糖刺激4h后各组INS－1的胰岛素分泌Table 1 Insulin releasing of INS-1 cells 4 hours after stimulated by different glucose concentration(±s，ng/L，n=3)

*P＜0.01 compared with 0 mmol/L;#P＜0.01 compared with MSCV-EGFP．

mmol/L MSCV-EGFP 0.185+0.004 0.353+0.006* 0.659+0.010* 0.846+0.006 group 0 mmol/L 5.6 mmol/L 11.1 mmol/L 33.3*MSCV-EGFP-R20 0.198+0.005 0.435+0.007*# 0.816+0.015*# 1.166+0.014*#

2.2 MMT法检测细胞增殖活性情况:经R20病毒上清感染的INS-1细胞的A值为0.658±0.007，显著高于EGFP感染组的0.579及空白对照组的0.01。

2.3 放射免疫法测定胰岛素分泌水平:在3种葡萄糖浓度的培养液中培养刺激4h后，两组细胞均可测到胰岛素的分泌，且胰岛素的分泌水平随葡萄糖浓度的增高而增加;被R20感染的即有活性STAT5A表达的INS-1细胞系分泌的胰岛素浓度高于EGFP对照组(P＜0.01)(表1)。

3 讨论

β细胞功能衰减和胰岛素抵抗是2型糖尿病发病机制中的两个重要环节。对于东方人群而言β细胞功能衰减更重要。胰腺β细胞功能的保持与细胞的数目及大小即β细胞群的多少有关，对动物模型的研究和对人类胰腺组织的观察发现胰腺β细胞群不是静止不变的［2］，成年哺乳动物的β细胞可以通过自我复制来获得和补充正常群［3］。从治疗的角度来看，在胰腺β细胞面临代谢和免疫攻击时驱动β细胞的增殖、分化，抑制其凋亡，增强β细胞的存活能力从而增加患者的胰腺β细胞群有改善或治愈糖尿病的潜在可能。本实验利用反转录病毒介导的持续激活的STAT5A质粒DNA来制备病毒上清感染胰腺肿瘤细胞系INS-1细胞，从而获得能表达高生物活性STAT5A的INS-1细胞。在STAT5A高活性的INS-1细胞中观察到了比对照组增高的生长活力。两组INS-1细胞经葡萄糖刺激后均有胰岛素的分泌增加，而且在有高STAT5A活性的INS-1细胞中测到的胰岛素分泌水平明显高于对照组，提示STAT5A作为一种信号传导与转录激活因子，可能通过促进胰岛细胞的增殖分化来增进其胰岛素的分泌能力，这对于治疗以胰岛β细胞功能进行性衰退为特征的2型糖尿病有积极的意义，但是这还需要进行进一步的动物实验来证实。

［1］Brelje TC，Stout LE，Bhagroo Nv，et al．Distinctive roles for prolactin and growth hormone in the activation of signal transducer and activator of transcription 5 in pancreatic islets of langerhans［J］．Endocrinology，2004，9:4162 －4175．

［2］Lee YC，Nielsen JH．Regulation of beta cell replication［J］．Mol Cell Endocrinol，2009，297:18 －27．

［3］Nir T，Melton DA，Dor Y．Recovery from diabetes in mice by β cell regeneration［J］．J Clin Invest，2007，117:2553－2561．