抗艾滋病病毒蛋白CVNH在*大肠杆菌中表达条件的优化

李 宁，孙君波，韦 剑，丘力功，王 艇，苏应娟

(1.中山大学生命科学学院，广东广州 510275;2.广州拜迪生物医药有限公司，广东广州 511495;3.中国科学院武汉植物园湿地演化与生态恢复湖北省重点实验室，湖北武汉 430074)

蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin-N，CVN)是由美国学者Boyd等［1］从椭孢念珠藻Nosto celliposporum提取物中发现的一种新型、具抗艾滋病病毒活性的蛋白。CVN为单链蛋白，含101个氨基酸。它可被分为两个重复单元，每个单元长约50个氨基酸，且含一个二硫键 (分别为C8－C22和C58－C73);该蛋白无翻译后修饰［2］。三维结构上，两个CVN重复借助一者的三链β折叠和另一者的β发夹之间的相互作用，彼此结合形成包含两个折叠型结构域、沿长轴伸展的长椭圆形对称分子［3］。和糖蛋白中寡糖结合的位点就分别位于长轴两端的深缝中，但它们同糖的亲和性一高一低［4］。CVN的物理化学性质非常稳定，能抵抗变性剂、去垢剂和有机溶剂的作用以及反复冻融和高温处理。经100℃加热15 min后，CVN仍能保持抗病毒活性。CVN的抗HIV活性主要表现在它能阻断由HIV表面糖蛋白介导的病毒—细胞融合途径［1］。体外研究表明，CVN能和HIV衣壳糖蛋白gp120特异、高亲合性地结合，干扰gp120与靶细胞受体CD4分子之间的相互作用，并抑制HIV感染宿主细胞［1，5－6］。此外，CVN 对埃博拉病毒 (Ebola)和流感病毒也有很高的抗病毒活性［7－8］。

除蓝细菌外，在一些细菌、真菌和蕨类植物中也发现有 CVN同源基因 (cyanovirin-N homology，CVNH)存在，它们共同组成CVNH蛋白家族。该家族成员的结构域折叠方式同蓝藻 CVN相匹配。进化上，它们所共有的抗HIV结构域在真核生物中极其保守，而且表现出相似的抗病毒活性［4，9－10］。

目前，有关CVN的研究主要集中在蛋白质晶体的三维结构、抗HIV活性及其机制等方面［1，11］，而涉及CVNH的研究则还相对很少。在前期研究中，我们首次获得水蕨Ceratopteris thalictroides CVNH基因 (CtCVNH)的全长序列［10］。随后，在对水蕨CVNH编码序列进行优化后，又构建出pET32a-CtCVNH的原核表达载体，并对其进行了诱导表达。在诱导表达的过程中，很多因素影响重组菌的生长及目的蛋白表达。这些因素包括培养基的类型及成分、培养基初始pH值、接种量、培养温度、诱导时机、诱导剂的浓度及诱导时间等。本研究对CVNH蛋白在大肠杆菌中表达条件展开了优化，以期获得较高的CVNH蛋白表达量，这为进一步开展CVNH的药物研制和开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

表达菌株Rosetta 2(DE3)为本实验室保存。

1.2 培养基

种子液体培养基为LB，其它培养基为 TB、SOB、SOC、M9、2×YT，配制方法参考《分子克隆实验指南》［12］。使用前添加氨苄青霉素 (100 μg·mL－1)、氯霉素 (34 μg·mL－1)。

1.3 试剂与仪器

Yeast Extract、Tryptone均为英国OXOID公司生产;丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、异丙基硫代－β－D半乳糖苷 (IPTG)为Genview公司生产;氨苄青霉素、甘油、甲叉双丙烯酰胺为Sigma公司生产;考马斯亮蓝R－250为USB分装;N，N，N＇，N＇－四甲基乙二胺 (TEMED)、过硫酸铵 (APS)为生工生物工程 (上海)有限公司生产;乳糖为广东环凯微生物科技有限公司生产;其余试剂均为国产分析纯。

SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 (苏州净化设备有限公司);101－1A型数显式电热恒温干燥箱 (沪越科学实验仪器厂);恒温培养摇床THZ－100(上海一恒科学仪器有限公司);DYY－8C型电泳仪 (北京市六一仪器厂);Eppendorf AG离心机;CyberScan pH510台式pH计。

1.4 培养方法

取－80℃保存的重组CVNH甘油菌，划LB固体培养基平板，37℃培养12 h，挑取单克隆菌落接入LB液体培养基中，37℃，220 r·min－1摇床振荡培养过夜，获得种子液。优化前的培养条件为:将培养好的种子液按1%接种量接入装有LB培养基的三角瓶中，37℃，220 r·min－1摇床振荡培养3 h时 (A600nm约为0.6～0.9)，取1 mL诱导前的菌液4℃保存备用。之后，用IPTG(1 mmol·L－1)诱导表达4 h，取1 mL诱导后的菌液，将诱导前后的菌液12 000 r·min－1离心1 min收集沉淀。将菌体重悬于40 μL蒸馏水中，加入10 μL 5×蛋白点样缓冲液。100℃水煮裂解10 min后，制成SDS-PAGE电泳蛋白样品，－20℃保存备用。点样前，样品12 000 r·min－1离心10 min。

1.5 菌体浓度的测定

比色法测定，以600 nm处的吸光度A600nm表示。

1.6 CVNH蛋白表达量的表示方法

1.6.1 目的蛋白含量 (%) 取电泳蛋白样品上清液上样，采用w=5%浓缩胶和w=15%分离胶的SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R－250染色。脱色后，用BandScan软件对凝胶进行分析，计算每条泳道中目的蛋白的含量。

1.6.2 菌体干质量 (菌体生长量) 取10 mL诱导后的样品，12 000 r·min－1离心3 min，获菌体沉淀，80℃烘干至恒量，称量［13］。

CVNH蛋白表达量=目的蛋白含量×菌体干质量［14］。

2 结果与分析

2.1 菌体生长曲线的测定

在20 mL TB培养基中按1%接种量接入种子液，37℃，220 r·min－1摇床振荡培养，在第0－5 h间，每隔半小时取菌液300 μL测A600nm值;在第5－8 h间，每隔1 h取菌液300 μL测A600nm值。实验重复2次。菌体生长曲线如图1。

图1 重组大肠杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curve of recombinant E.coli

菌体生长曲线呈典型的S型，第0－0.5 h间为停滞期，第0.5－1 h间为对数生长前期，第1－2 h间为对数生长中期，第2－3 h间为对数生长后期，第3－8 h间为稳定期。

2.2 不同培养基对CVNH蛋白产量的影响

本实验分别选取LB、TB、SOB、SOC、M9、2×YT、LB+M9和2×YT+M9八种培养基，在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳培养基。实验重复2次，结果见图2。

图2 不同培养基对CVNH蛋白产量的影响Fig.2 Influence of different culture media on CVNH protein yields

CVNH蛋白产量在TB培养基中最高。TB培养基含有较多的有机物、氨基酸、核苷酸、生长因子以及一些微量元素，被确定为CVNH蛋白表达的最佳培养基。

2.3 不同诱导时机对CVNH蛋白产量的影响

当A600nm分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9时加入IPTG进行诱导，在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳诱导时机。实验重复2次，结果见图3。

图3 不同诱导时机对CVNH蛋白产量的影响Fig.3 Influence of different induction time on CVNH protein yields

结果发现，CVNH蛋白产量随着A600nm的增加呈现先增加后减少的趋势。当A600nm为0.6时，CVNH蛋白产量最高。当A600nm值小于 0.6时，CVNH蛋白产量随着A600nm的增加而增加。此时，大肠杆菌生长状态为潜伏期及对数生长前期，菌体密度较低，蛋白总产量较低。当A600nm为0.6时，大肠杆菌处于对数生长中期。此时菌体密度较高，可诱导产生最多的目的蛋白。当A600nm继续增加时，目的蛋白的产量会稍有下降。此时处于稳定期及衰亡期，部分菌体已死亡，蛋白开始自溶，导致蛋白产量降低。

2.4 不同诱导剂浓度对CVNH蛋白产量的影响

本文比较了IPTG和乳糖的诱导效果。IPTG的浓度分别为 0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 和 3.2 mmol·L－1，而乳糖的质量浓度分别为 0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 g·L－1。在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳诱导浓度。实验重复2次，结果见图4。

图4 不同诱导剂浓度对CVNH蛋白产量的影响Fig.4 Effects of concentrations of different induction agents on CVNH protein yields

随着IPTG和乳糖质量浓度的增加，CVNH蛋白产量均呈现先增加后减少的趋势，但变化趋势不明显，说明菌种对IPTG和乳糖的诱导作用比较敏感。当IPTG诱导时，随着其浓度的增加，菌体的质量呈下降趋势;而乳糖作诱导剂时，菌体的质量基本不变。表明IPTG对菌的生长具有抑制作用。IPTG浓度达到0.8 mmol·L－1时，目的蛋白的产量最高。IPTG浓度继续增加，其抑制菌种效果也增加，目的蛋白的产量随之降低。乳糖质量浓度在1.6 g·L－1时，目的蛋白产量最高，且高于IPTG诱导的产量。乳糖质量浓度继续增加，其降解物葡萄糖浓度也增加，就会产生抑制菌种生长的乙酸等物质，导致目的蛋白的产量降低。因此，确定1.6 g·L－1的乳糖为最佳诱导剂。

2.5 不同诱导时间对CVNH蛋白产量的影响

本文用1.6 g·L－1乳糖分别诱导1、2、3、4、5、6、8和10 h，并以 IPTG诱导4 h作为对照(ck)。在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳诱导时间。实验重复2次，结果见图5。

图5 不同诱导时间对CVNH蛋白产量的影响Fig.5 Effect of different expression time on CVNH protein yields

随着乳糖诱导时间的增加，CVNH蛋白产量先升高后降低。当乳糖诱导6 h时，CVNH蛋白的产量最高，而且比IPTG诱导4 h的CVNH蛋白量高。乳糖是二糖诱导剂，需先降解为葡萄糖和半乳糖，半乳糖再诱导CVNH蛋白的表达。这一过程需要多种酶的参与，因此诱导时间比IPTG长。但随着时间的增加，会产生乙酸等抑制物，导致CVNH蛋白产量降低。故选用乳糖诱导6 h作为最佳诱导时间。

2.6 不同碳源对CVNH蛋白产量的影响

本文在TB培养基中分别添加:φ=2%甘油、20 g·L－1葡萄糖、20 g·L－1蔗糖、φ =2% 甲醇、φ=2%乙醇、φ=2%异丙醇和φ=2%丙酮为碳源，以不加碳源的TB培养基为对照 (ck)。在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳碳源。实验重复2次，结果见图6。

当培养基中无任何碳源时，CVNH蛋白产量最高。以葡萄糖为碳源时，CVNH蛋白的产量最低，但它的菌体干质量最高，说明葡萄糖可促进菌体生长。另外，以乳糖作为诱导剂时，乳糖分解会产生葡萄糖，二者共同作用，使葡萄糖的含量增加，促进菌体生长。然而，乳糖也会产生大量乙酸，抑制目的蛋白表达，使其表达量降低。另外，以醇类及酮等有机试剂为碳源时，目的蛋白的产量与添加糖类相差不大。因而，CVNH蛋白表达不需再添加任何碳源。

图6 不同碳源对CVNH蛋白产量的影响Fig.6 Influence of different carbon source on CVNH protein yields

2.7 不同氮源对CVNH蛋白产量的影响

本文使用的TB培养基含有胰蛋白胨和酵母提取物两种氮源，二者的比例不同会影响CVNH蛋白的表达。首先固定胰蛋白胨质量浓度 (12 g·L－1)，改变酵母提取物的添加量，分别为0、4、6、12、24和36 g·L－1(即添加比例分别为胰蛋白胨:酵母提取物 =1∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3);然后固定酵母提取物含量 (24 g·L－1)，改变胰蛋白胨的添加量，分别为0、8、12、24、48和72 g·L－1(即添加比例分别为酵母提取物:胰蛋白胨=1∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)。另外，其他无机氮源对蛋白表达量也有影响。为此，我们固定酵母提取物 (24 g·L－1)和胰蛋白胨 (12 g·L－1)含量，分别添加了硫酸铵、氯化铵、硝酸铵，尿素和乙酸铵五种无机氮源，添加量以氮元素摩尔数相等为依据。在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量来确定最佳氮源。实验重复2次，结果见图7。

当氮源为 24 g·L－1酵母提取物和 72 g·L－1胰蛋白胨时，CVNH蛋白产量达到最高。虽然曲线仍处于上升趋势，但变化趋势变小。仅以胰蛋白胨为氮源，CVNH蛋白百分含量较高，但菌体干质量偏低，表明胰蛋白胨可促进蛋白表达。而仅以酵母提取物为氮源，菌体干质量较高，但CVNH蛋白含量较低，说明酵母提取物能促进菌体生长。另外，添加的其它无机氮源并没有明显提高蛋白表达量。因此，考虑到培养的经济性，我们决定不再增加其他氮源。故选取 24 g·L－1酵母提取物和 72 g·L－1胰蛋白胨作为最佳氮源。

图7 不同氮源对CVNH蛋白产量的影响Fig.7 Effect of different nitrogen source on CVNH protein yields

2.8 不同初始pH对CVNH蛋白产量的影响

本文初始 pH分别为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在其它条件相同的情况下培养大肠杆菌，根据CVNH蛋白产量确定最佳初始pH。实验重复2次，结果见图8。

图8 不同初始pH对CVNH蛋白产量的影响Fig.8 Influence of different initial pH on CVNH protein yields

随着培养基初始pH的增加，CVNH蛋白产量先增加后减少，当初始pH为8.0时，CVNH蛋白产量达到最高。本研究优化的最佳培养基初始pH为8.0。

2.9 CVNH蛋白产量优化前后的对比

在不同影响因素的优化过程中，存在多种外部因素的影响，如菌种和培养环境的差异。为检测优化后的蛋白表达效果，在相同的条件下，我们比较了优化前后的蛋白表达量。优化后的实验条件为:含 24 g·L－1酵母提取物和 72 g·L－1胰蛋白胨的 TB培养基，培养基初始pH为8.0，菌液A600nm为0.6时加入1.6 g·L－1乳糖诱导6 h。根据CVNH蛋白产量判断优化的效果。实验重复2次，结果见图9。

优化后的目的蛋白表达量增高，CVNH蛋白的表达量较优化前提高了1.9倍，说明优化效果明显。

图9 优化前后CVNH蛋白产量的对比Fig.9 Comparison of CVNH protein yields between optimized and not optimized conditions

3 讨论

以大肠杆菌为代表的原核表达系统目前广泛用于外源基因的表达。作为宿主菌，大肠杆菌遗传背景清晰、易于控制、培养条件简单、生长迅速，短时间内可获得大量的蛋白质［15］。大肠杆菌Rosetta 2是BL21的改造菌种，增加了相容性的氯霉素抗性质粒，补充了七种稀有密码子 (AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA、CGG)对应的的tRNA，因而提高了含稀有密码子外源基因的表达量［16］。CVNH蛋白是最近发现的CVNH蛋白家族新成员，含有与CVN非常相似的抗HIV结构域。在前期研究中，我们首先尝试利用CVNH编码序列进行重组蛋白的制备。由于在编码序列中含有多个稀有密码子，而且存在两个稀有密码子串联存在的现象，我们选择可以额外提供稀有密码子tRNA的Rosetta 2(DE3)作为表达宿主菌，避免由稀有密码子造成的翻译问题［17］。

pET表达系统是一种高效的原核表达系统，它利用T7启动子控制外源基因的表达，而T7启动子由乳糖操纵子操控的T7 RNA聚合酶控制。外源基因克隆到宿主菌中并不立即表达，只有在诱导剂的作用下，诱导乳糖操纵子操控的T7 RNA聚合酶表达，从而启动外源基因的表达。因此，将菌体的生长和外源蛋白的表达分开，可以避免相互影响，便于控制。

本文主要探讨了最佳培养基类型及成分、培养基初始pH、诱导时机、诱导剂浓度及诱导时间对CVNH蛋白在大肠杆菌中表达的影响。以摇瓶培养的方式，对CVNH在大肠杆菌E.coliRosetta 2(DE3)中的培养条件进行了优化。具体分述如下:①培养基是宿主菌生长繁殖和目的蛋白积累的能量和物质来源，不同培养基的营养物质不同，它们对大肠杆菌的生长和CVNH蛋白的表达有影响［18］。本文确定TB培养基为最佳培养基。该培养基以甘油为碳源，可减少培养过程中乙酸的产生;磷酸盐缓冲液可维持pH的稳定，有利于宿主菌的生长及CVNH蛋白的表达。②诱导的时机非常重要［19］。诱导时机的不同，会导致宿主菌生长状态和菌体密度的不同，因而蛋白的表达量也不同。我们确定A600nm在0.6时为最佳诱导时机。③诱导剂对于外源基因的高效、稳定表达也极为重要，不同类型和浓度的诱导剂对于目的蛋白的表达量有影响［20］。IPTG虽然是常用的诱导剂，能高效的诱导蛋白的表达。但对菌体存在抑制作用和毒性，会影响质粒的稳定性，促使质粒丢失，而且价格昂贵，不适于大规模发酵生产。发酵生产中常使用乳糖为诱导剂，替代IPTG。乳糖对宿主菌没有抑制作用，可提供碳源。本文确定1.6 g·L－1的乳糖为最佳诱导剂。④诱导时间的长短能影响蛋白的表达量。诱导时间短，CVNH蛋白的表达量低;诱导时间长，乙酸等抑制物的产生会导致CVNH蛋白产量降低。本文选用乳糖诱导6 h为最佳诱导时间。⑤碳源是大肠杆菌生长过程中的能量来源，能提供合成原料和细胞碳架，因而不同的碳源对蛋白产量的影响较大［21］。本文CVNH蛋白表达不需再添加任何额外的碳源。⑥氮源是宿主菌代谢过程中含氮物的原料。培养基的氮源有两类:无机氮源和有机氮源。本文添加的其它无机氮源并没有明显提高CVNH蛋白表达量，因而决定不再增加其他氮源，仅以TB 培养基中的 24 g·L－1酵母提取物和 72 g·L－1胰蛋白胨作为最佳氮源。⑦pH能影响培养基中营养物质的离子化程度和酶的活性，从而影响宿主菌对营养物质的吸收和目的蛋白的高效表达［22］。大肠杆菌表达外源蛋白一般最佳pH为6.0～6.5，而本研究优化的最佳培养基初始pH为8.0。这是因为大肠杆菌在培养过程中，会有乙酸等代谢物的产生和累积，使培养基的pH值下降到接近最佳外源蛋白表达的pH范围。

因此，优化后的诱导条件是:含24 g·L－1酵母提取物和72 g·L－1胰蛋白胨的TB培养基、培养基初始pH为8.0、菌液A600nm为0.6时加入1.6 g·L－1乳糖诱导6 h。另外，CVNH蛋白的表达量较优化前提高了1.9倍，优化效果明显。这为工业化发酵提供了理论依据，也为进一步开展CVNH的药物研制和开发奠定了基础。

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