广东凉茶颗粒苷类化学成分研究*

王志芳，符 崖，向 俊，黄兆胜，张中强，宋化灿，钟 莹，张翠仙

(1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;2.广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510120;3.中国广州分析测试中心广东省分析测试技术公共实验室，广东广州 510070)

广东凉茶颗粒 (王老吉)是由10味中药按照不同比例组成 (岗梅、山芝麻、五指柑、淡竹叶、木蝴蝶、布渣叶、火炭母、金沙藤、广金钱草、金樱根)。其味甜、苦，具有清热解暑，去湿生津的功效，用于四时感冒，发热喉痛，热积滞，口干尿黄。自2006年广东凉茶成功申请国家非物质文化遗产，使其在国内外盛销。然而目前国内外关于凉茶物质基础及质量标准研究相关报道甚少［1］。为充分开发凉茶国际市场、药效物质基础及谱效结合指纹图谱，本课题组采用正反相硅胶、凝胶等多种现代色谱分离技术对广东凉茶颗粒 (王老吉)甲醇提取物乙酸乙酯相进行了系统研究，从中分离得到5个化合物，采用物理常数对照和现代波谱分析方法确定其结构分别为:4-p-香豆酸-D-吡喃葡萄糖苷 (1)、2α，3α，19α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、2α，3β，19α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡 喃 葡萄 糖 (3)、2α，3β，19α，23-四羟基乌苏-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (4)、木犀草素-6-C-葡萄糖苷 (5)。化合物1为首次从自然界中分离得到的天然产物，且首次报道其NMR数据。文献查阅表明，化合物1为苯乙醇苷类化合物的生源前体［2－3］。苯乙醇苷类化合物具有保肝、抗氧化、免疫调节、增强记忆、抗衰老等广泛的生物学活性［4］，但此化合物的药理活性还有待于进一步验证。1，2，3，4，5均首次从广东凉茶颗粒中分离得到，为进一步研究其药效及药理活性打下基础。

图1 广东凉茶中分离得到的苷类成分Fig.1 Glycosides from Guangdong Liangcha

1 结果与讨论

化合物1，淡黄色针晶 (MeOH)，FeCl3反应阳性，提示1可能为芳香酚酸类化合物;Molish反应阳性暗示其为苷类。ESI－MSm/z:325［MH］－结合 NMR数据 (1×CH2，11×CH，3×C)确定化合物1分子式为C15H18O8，不饱和度为7。NMR显示1有1个酯羰基 ［δC169.2/169.1(s)］，1个对位取代的芳香环 ［(δH7.44(2H，dd，J=2.0，8.0 Hz)，6.82(2H，dd，J=2.0，8.0 Hz)］和 ［δC161.2(s)，146.7/146.7(d)，131.1(d)，127.1(s)，116.8(d)］，1个反式共轭双键 ［δH7.62(1H，d，J=16.0 Hz)，6.33(1H，d，J=16.0 Hz)和 δC146.7/146.7(d)，115.0/114.9(d)］，说明1存在典型苯丙素结构单元。同时NMR还显示1明显存在糖的端基信息:δH5.80(1H，d，J=4.0 Hz)和δC98.2(d)和94.0(d)。

将化合物1进行酸水解，糖的GLC分析结果表明该化合物所含的糖为D－葡萄糖。将化合物1中糖的NMR数据与肉苁蓉苷Cistanoside F相对应糖的NMR数据 (见图2，结构特征:由E－Δ7，8－3，4－二羟基－苯丙酰基 (即咖啡酰基)、葡萄糖和鼠李糖组成，鼠李糖与葡萄糖的3位连接)对照［5］，基本一致，故确定1为4－p－香豆酸－D－吡喃葡萄糖苷［6－7］。

图2 肉苁蓉苷cistanoside F结构示意图Fig.2 Structure of cistanoside F

表1 化合物1和cistanoside F糖部分13C NMR数据 (CD3OD)Table 1 13C NMR analysis of glucose 1 and cistanoside F(CD3OD)

化合物2，白色针状结晶 (CHCl3－MeOH)，θmp230～232℃;φ=5%硫酸乙醇溶液显蓝色斑点，Libermann－Burchard和Molish反应均为阳性。ESI－MSm/z673［M+Na］+，结合1H NMR、13C NMR和DEPT谱 (7×CH3，9×CH2，12×CH和8×C)确定化合物2分子式为C36H58O10，不饱和度为8。1H NMR共显示7个－CH3信号峰，分别为δH0.92、1.05、1.22、1.26、1.38、1.61(each 3H，s)和 1.08(3H，d，J=6.4 Hz)。另外 δH5.40(1H，br.s)及δC139.4(s)和128.6(d)说明化合物2存在1个双键。δC177.2(s)提示含有羰基碳，除此外无任何不饱和度信息，提示该化合物可能为熊果烷型三萜。δH6.30(1H，d，J=8.0 Hz)和δC96.0(d)为一典型糖的端基信息，说明2为含有1个糖的皂苷类化合物。同时C－28化学位移值为δC177.2，说明其为酯苷键。将2进行酸水解，糖的GLC分析结果表明该化合物所含的糖为β－D－葡萄糖。将2的NMR数据与文献［8］对照基本一致，确定2为2α，3α，19α－三羟基乌苏－12－烯－28－酸28－O－β－D－吡喃葡萄糖苷。经文献检索发现2首次从广东凉茶颗粒中分离得到。采用HPLC－MS方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于金樱根。

化合物3，白色针状结晶 (MeOH)，θmp219～221℃;φ=5%硫酸乙醇溶液显蓝色斑点，Libermann－Burchard和Molish反应均为阳性。ESI－MSm/z673［M+Na］+结合13C NMR和DEPT谱 (7×CH3，9×CH2，12×CH和8×C)确定3分子式为C36H58O10，不饱和度为 8。1H NMR共显示 7个－CH3信号峰，分别为 δH1.67，1.40，1.26 1.21，1.08，1.06(each 3H，s)和1.09(3H，d，J=5.6 Hz)。另外 δH5.02(1H，br.s)及 δC139.4(s)和128.5(d)说明化合物3存在1个双键。δC177.1(s)提示含有羰基碳，除此外无任何不饱和度信息，提示该化合物可能为熊果烷型三萜。δH6.30(1H，d，J=8.0 Hz)和δC96.0(d)为糖的端基信息，说明3也为含有1个糖的皂苷。将3的NMR数据与2对照，发现除了C－3的化学位移值明显想低场移动4.5外［3:δC84.0(d，C－3);2:δC79.5(d，C－3)］，其他基本一致，将3的NMR数据与文献［9］对照基本一致，故确定3为2α，3β，19α－三羟基乌苏－12－烯－28－酸 28－O－β－D－吡喃葡萄糖苷。经文献检索发现3首次从广东凉茶颗粒中分离得到。采用HPLC－MS方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于金樱根。

化合物4，白色粉末 (CHCl3－MeOH)，θmp271～272℃，φ=5%硫酸乙醇溶液显蓝色斑点，Libermann－Burchard和Molish反应均为阳性，ESI－MSm/z:689［M+Na］+;结合1H NMR、13C NMR和DEPT谱 (6×CH3，10×CH2，12×CH和8×C)确定4分子式为C36H58O11，不饱和度为8。1H NMR共显示6个－CH3信号峰，分别为δH0.71，0.78，1.21，1.30，1.34(each 3H，s)和 1.04(3H，d，J=4.0 Hz)，另外 δH5.50(1H，br.s)及δC139.7(s)和129.5(d)说明4存在1个双键。δC178.6(s)提示含有羰基碳，除此外无任何不饱和度信息，提示该化合物可能为熊果烷型三萜。δH5.33(1H，d，J=6.8 Hz)和 δC95.8(d)为一典型的糖的端基信息，说明4也为含有1个糖的三萜皂苷。将4的NMR数据与3对照，发现少了一个甲基信息 ［δC29.5(q，C－23)］而增加了一个羟甲基信息 ［δC66.6(t，C－23)］，其他基本一致。将4的NMR数据与文献［8］对照基本一致，故确定4为2α，3β，19α，23－四羟基乌苏－12－烯－28－酸 28－O－β－D－吡喃葡萄糖苷。经文献检索发现4首次从广东凉茶颗粒中分离得到。采用HPLC－MS方法与单味药化学成分对比研究发现，其亦可能来源于金樱根。

化合物5，淡黄色粉末 (MeOH)，AlCl3、盐酸－镁粉反应阳性，暗示5为黄酮类化合物。NMR端基碳信息δC73.1(d)，说明5可能是碳苷类化合物，同时MS中m/z299［M－149］－进一步提示5为碳苷类化合物［10］。ESI－MSm/z:447［M－H］－结合NMR谱 (1×CH2，10×CH和10×C)确定化合物5分子式为C21H20O11，不饱和度为12。NMR中δH6.87(1H，s)，6.67(1H，s)为黄酮类化合物H－3和H－8的典型特征信息。δC183.0(s)为黄酮类化合物4位羰基典型特征。而δH7.86(1H，d，J=2.0 Hz)，7.49(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz)，7.27(1H，d，J=8.4 Hz)显色 B环为3'，4'－二氧取代的黄酮类化合物。δH5.83(1H，d，J=9.6 Hz，Glc－1″)和 δC110.2(s)为典型的C－6取代的黄酮碳苷类化合物特征。将其NMR数据与文献报道木犀草素－6－C－葡萄糖苷对照［11］，基本一致。故鉴定5为木犀草素－6－C－葡萄糖苷。经文献检索发现此化合物首次从广东凉茶颗粒中分离得到。采用HPLC－MS方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于广金钱草。

2 实验部分

2.1 材料与仪器

北京泰克光学仪器厂X－6型熔点仪 (熔点未矫正);旋光由德国POLARTRONIC H H W5 polarimeter(SCHMIDT+HAENSCH，Germany)测定;NMR数据由瑞士Bruker公司 AVANCE AV 400超导核磁共振仪测试;质谱由美国 Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色谱－质谱联用仪测试完成;旋转蒸发仪 (RE2010，巩义市予华仪器有限责任公司);电子分析天平 (AUY120，广州湘仪机电设备有限公司);凝胶为Sephadex LH－20(日本YMC);柱层析硅胶 (200～300目)为青岛海洋化工有限公司生产;所有溶剂、试剂均为广州化学试剂厂产品 (分析纯)。

广东凉茶颗粒 (广州王老吉药业股份有限公司批号:1002037)。

2.2 提取与分离

广东凉茶颗粒 (10 kg)，经甲醇渗漉提取，减压回收甲醇，得深黄褐色浸膏 (1.18 kg)。浸膏用蒸馏水捏溶，依次用石油醚 (PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇 (n－BuOH)萃取，萃取液减压浓缩得 PE相 (5 g)，EtOAc相 (51.5 g)，n－BuOH相 (188.0 g)和H2O相 (500 mL)。

乙酸乙酯部位 (51.5 g)进行硅胶 (200～300目)柱层析。以极性逐渐增加的氯仿－甲醇溶剂体系 (V(EtOAc)∶V(MeOH)=19∶1，17∶3，7∶3，6∶4，1∶1，4∶6，2∶8，0∶100)洗脱。TLC 跟踪，得到14个流分 (Fr1至Fr14)。流分Fr－6经硅胶 (200～300目)柱层析 (V(CHCl3)∶V(Acetone)=3∶2)和凝胶柱层析 (洗脱剂V(CHCl3)∶V(MeOH)=1∶1)的化合物 2(30 mg)、3(20 mg);流分Fr－7经硅胶 (200～300目)柱层析 (V(EtOAc)∶V(MeOH)=15∶1)和凝胶柱层析 (洗脱剂V(CHCl3)∶V(MeOH)=1∶1)的化合物1(15 mg);流分Fr－8经硅胶(200～300目)柱层析 (V(CHCl3)∶V(MeOH)=6∶1)和凝胶柱层析 (洗脱剂V(CHCl3)∶V(MeOH)=1∶1)的化合物4(25 mg);流分Fr－9经硅胶 (200～300目)柱层析 (V(PE)∶V(EtOAc)∶V(MeOH)=2∶2∶1)和凝胶柱层析(洗脱剂V(MeOH)∶V(H2O)=7∶3)的化合物5(15 mg)。

2.3 化合物酸水解

化合物 (1和2各5 mg)用φ=9%HCl水溶液在90℃条件下水解5 h，反应结束后冷却。反应液冷冻干燥，用吡啶溶解，添加氯化L－半胱氨酸甲基酯60℃条件下硅醚化，反应液离心后取上清液用GLC检测。

2.4 化合物的物理常数及波谱数据

化合物1:淡黄色针晶 (MeOH)，ESI－MSm/z:325［M －H］－;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δH:7.62(1H，d，J=16.0 Hz)，7.44(2H，dd，J=2.0，8.0 Hz)，6.82(2H，dd，J=2.0，8.0 Hz)，6.33(1H，d，J=16.0 Hz)，5.80(1H，d，J=4.0 Hz，Glc－1'，4.23～4.54(4H，m);3.98～4.07(1H，m)，3.72(1H，dd，J=9.6，9.2 Hz)，3.48 ～ 3.58(1H，m);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δC:127.1(C －1，s)，131.1(C －2，6，d)，116.8(C －3，5，d)，161.2(C －4，s)，146.7/146.7(C －7，d)，115.0/114.9(C －8，d)，169.2/169.1(C －9，s)，98.2/94.0(C －1'，d)，73.7/72.0(C － 2'，d)，77.9/76.2(C － 3'，d)，71.7/70.8(C － 4'，d)，75.4/74.8(C － 5'，d)，64.9/64.8(C －6'，t)。

化合物2:白色针状结晶 (CHCl3－MeOH)，θmp230～232 ℃，［α］+7.8°(c，0.84，MeOH);ESI－MSm/z673［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:6.30(1H，d，J=8.0 Hz，Glc －1'，5.40(1H，br.s)，4.20～4.50(6H，m)，2.92(1H，s)，2.43 ～ 2.51(1H，m)，1.61，1.38，1.26，1.22，1.05，0.92(each 3H，s)，1.08(3H，d，J=6.4 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:43.1(C－1，t)，66.3(C －2，d)，79.5(C －3，d)，38.8(C－4，s)，48.9(C－5，d)，18.8(C －6，t)，33.7(C－7，t)，41.0(C－8，s)，47.8(C－9，d)，38.9(C －10，s)，24.3(C －11，t)，128.6(C－12，d)，139.4(C－13，s)，42.3(C－14，s)，29.6(C－15，t)，26.9(C －16，t)，48.8(C－17，s)，54.6(C－18，d)，72.8(C －19，s)，42.3(C －20，d)，27.2(C －21，t)，37.9(C －22，t)，29.4(C－23，q)，22.5(C－24，q)，16.9(C－25，q)，17.7(C －26，q)，24.7(C －27，q)，177.2(C－28，s)，26.3(C－29，q)，16.9(C－30，q)，96.0(C －1'，d)，74.2(C －2'，d)，79.1(C －3'，d)，71.5(C －4'，d)，79.4(C －5'，d)，62.6(C －6'，t)。

化合物3:白色针状结晶 (MeOH)，θmp219～221℃;ESI－MSm/z:673［M+Na］+;［α］+4.1°(c，0.84，MeOH);1H NMR(400 MHz，Pyrd5)δH:6.30(1H，d，J=8.0 Hz，Glc －1'，5.55(1H，t，J=3.2 Hz)，5.02(1H，br.s)，4.20 ～4.51(6H，m)，4.04～4.14(2H，m)，3.38(1H，d，J=9.6 Hz)，2.93(1H，s)，2.44～2.52(1H，m)，1.67，1.40，1.26 1.21，1.08，1.06(each 3H，s)，1.09(3H，d，J=5.6 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:48.0(C －1，t)，68.8(C －2，d)，84.0(C－3，d)，38.7(C－4，s)，56.1(C －5，d)，19.2(C－6，t)，33.7(C－7，t)，40.8(C－8，s)，48.2(C－9，d)，40.0(C －10，s)，24.3(C－11，t)，128.5(C －12，d)，139.4(C －13，s)，42.3(C－14，s)，29.3(C－15，t)，26.3(C－16，t)，48.8(C －17，s)，54.6(C －18，d)，72.8(C－19，s)，42.3(C－20，d)，27.2(C－21，t)，37.9(C －22，t)，29.5(C －23，q)，16.8(C －24，q)，17.1(C －25，q)，17.8(C －26，q)，24.7(C－27，q)，177.1(C－28，s)，26.8(C－29，q)，17.6(C －30，q)，96.0(C －1'，d)，74.2(C －2'，d)，79.1(C －3'，d)，71.4(C －4'，d)，79.4(C －5'，d)，62.5(C －6'，t)。

化合物4:白色粉末 (CHCl3－MeOH)，θmp271～272℃，［α］+10.2°(c，1.01，MeOH);ESI－MSm/z:689［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δH:5.50(1H，br.s)，5.33(1H，d，J=6.8 Hz，Glc－1')，3.79～3.85(1H，m)，3.67～3.73(2H，m)，3.51(1H，d，J=8.8 Hz)，3.26～3.43(9H，m)，1.34，1.30，1.21，0.78，0.71(each 3H，s)，1.04(3H，d，J=4.0 Hz);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δC:48.0(C － 1，t)，69.7(C－2，d)，78.4(C －3，d)，42.9(C －4，s)，47.1(C－5，d)，19.3(C －6，t)，33.5(C －7，t)，41.3(C－8，s)，47.8(C－9，d)，39.0(C－10，s)，24.8(C －11，t)，129.5(C －12，d)，139.7(C－13，s)，42.8(C－14，s)，29.6(C －15，t)，26.5(C －16，t)，48.3(C －17，s)，55.0(C－18，d)，73.7(C－19，s)，48.0(C －20，d)，25.2(C－21，t)，38.3(C －22，t)，66.6(C－23，t)，13.8(C－24，q)，17.7(C－25，q)，16.6(C－26，q)，24.9(C －27，q)，178.6(C －28，s)，27.1(C－29，q)，17.6(C－30，q)，95.8(C－1'，d)，73.9(C －2'，d)，78.3(C －3'，d)，71.2(C －4'，d)，78.5(C －5'，d)，62.5(C －6'，t)。

化合物5:淡黄色粉末 (MeOH)，ESI－MSm/z:447［M －H］－，299［M －149］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:14.35(1H，s)，7.86(1H，d，J=2.0 Hz)，7.49(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz)，7.27(1H，d，J=8.4 Hz)，6.87(1H，s)，6.67(1H，s)，5.83(1H，d，J=9.6 Hz，Glc － 1″)，5.15(1H，t，J=9.6 Hz)，4.43～4.56(4H，m)，4.18(1H，m);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:164.8(C－2，s)，104.1(C－3，d)，183.0(C－4，s)，157.8(C－5，s)，110.2(C－6，s)，157.6(C－7，s)，94.8(C －8，d)，164.8(C －9，s)，105.0(C －10，s)，119.7(C －1'，s)，114.8(C －2'，d)，147.9(C － 3'，s)，151.8(C － 4'，s)，117.0(C －5'，d)，123.0(C －6'，d)，73.1(C －1'，d)，75.1(C －2'，d)，80.7(C －3'，d)，72.1(C －4'，d)，83.1(C －5'，d)，62.9(C －6'，t)。致谢:感谢中山大学分析测试中心姚俊华、关山越老师对化合物结构测试工作的支持。

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