红树林内生真菌K38和E33共培养代谢产物研究*

李春远，龚 兵，黄素萍，佘志刚，林永成，周世宁

(1.华南农业大学理学院生物材料研究所，广东广州 510642;2.中山大学化学与化学工程学院，广东广州 510275;3.中山大学生命科学学院，广东广州 510275)

海洋微生物已成为寻找新药先导化合物的新源泉［1］。红树林微生物是海洋微生物的重要组成部分。内生真菌K38和E33分别采集自我国湛江湿地红树植物秋茄叶片及麒麟菜枝干，生测结果表明二者单独发酵的粗提物基本不显示抗菌活性，但共培养液萃取物对小麦赤霉等多种危害农业和水果的病菌显示出较强抗菌作用［2］。前期我们分别系统研究了两株菌的代谢产物［3－7］，并进一步对两菌共培养产生的代谢产物进行了分离，共分离到十八种单体化合物，有两个是新化合物［8－12］。本文在上述基础上进一步开展了两株菌共培养代谢产物的研究，又分离鉴定了另外5种化合物，分别为Castaneiolide(1)，脑苷脂-1-O-吡喃葡萄糖基-(2S，3R，4E，2'R)-2-N-(2'-羟基棕榈酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine(2)，3β，7β，19-三羟基-5-烯-胆甾烷 (3)，3-羟基-4-(3-甲基-2-丁烯氧)基-苯甲醛(4)，对羟基苯甲醛 (5)，其中化合物1，2，3，4以往未从单独发酵的两株菌中分离到，化合物1，2，4为首次从海洋真菌里获得。

1 结果与讨论

化合物1的快原子轰击质谱给出准分子离子峰421［M+H］+，元素分析 (w)C 62.84%，H 6.72%，N 0，与理论值C 62.85%，H 6.71%，N 0对比并结合碳谱，推出分子式C22H28O8，计算不饱和度为9。碳谱结合DEPT谱可以看出22个碳中有9个季碳，2个次甲基碳，9个亚甲基碳和2个甲基碳，δ 167.8，167.2，166.2，165.8，的季碳提示分子中有4个酯羰基存在，由于分子没有这么多O，推测分子中可能存在两个酸酐。δ 146.8，145.3，144.7，142.6的季碳提示分子中有2个双键存在，剩余的不饱和度表明分子中还有3个环存在，很容易联想到可能有五元的酸酐环存在。δ 78.3，69.9根据化学位移和分子式判断是连氧的碳，表明分子中有2个羟基。1HNMR中δ 0.89和0.97的2个三重峰以及13CNMR中2个CH3和众多CH2的存在，提示分子中可能存在两条烷基链。由此判断出该化合物的结构与以往分离到 (－)－byssochlamic acid非常相似［4］，只是两条烷基链的长度和羟基数目不同，对照文献［13］数据基本一致，确定化合物1为Castaneiolide。化合物1结构新颖，属于 nonadride类衍生物，该类化合物目前在自然界发现的不超过15个。

化合物2的1H NMR谱中，出现CH2脂肪长链(δ 1.26附近)和2个末端甲基信号0.89(6H，t，6.7Hz)，推测分子中有2个脂肪烷基链。δ 8.35(1H，d，8.4 Hz，NH)和13C NMR 谱 175.5(CONH)及众多连氧碳信号显示分子有酰胺键和多羟基存在，表明该化合物为神经酰胺类化合物。13C NMR δ 50～106之间的碳共有9个连氧或连氮的信号，推测分子中存在一个糖基，其中δ 105.3是糖基的异头碳信号，δ 105.3，78.2，78.2，74.9，71.5，62.6数据与β－D－吡喃葡萄糖基本一致，此区间剩余的三个碳容易判断δ 54.5的碳连接酰胺中的氮原子，其他2个碳连2个羟基。δ 135.6，132.2，131.6，124.0表明分子中存在两个双键，1H NMR 中 δ 5.98(2H，m)，5.25(1H，m)表明其中一个双键碳为季碳，其他则为 CH，δ 1.62(3H，s)表明分子有一个CH3连在双键上。根据快原子轰击质谱给出的分子离子峰726［M－H］+，结合分子中存在2个羟基，2个双键，1个酰胺，1个CH3，可根据神经酰胺结构特点确定分子式为 C41H77NO9，在此基础上查阅文献［14］，对照相关数据基本一致，确定其结构为脑苷脂-1-O-吡喃葡萄糖基-(2S，3R，4E，2'R)-2-N-(2'-羟基棕榈酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine。

化合物3为白色针状结晶，EIMS给出分子离子峰418［M］+，结合13C NMR和DEPT推出分子式为C27H46O3，不饱和度为5。1H NMR谱中有4个甲基δ 0.93(3H，d，6.8 Hz)，0.88(6H，d，7.2 Hz)，0.75(3H，s)，13C NMR结合DEPT表明分子中存在一个羟甲基 δ 62.7，两个仲羟基 δ 72.5，71.1和一个三取代烯键δ 138.2，130.0。根据以上数据，结合不饱和度推测化合物为三羟基胆甾烯烷。进一步与文献 ［15］对照数据基本一致，化合物3被确定为3β，7β，19-三羟基-5-烯-胆甾烷。

化合物4的分子离子峰为207［M+H］+，结合13C NMR和DEPT推出分子式为C12H14O3，不饱和度为 5。1H NMR δ 6.97(1H，8.4Hz)，7.41(1H，dd，8.4，2.4Hz)，7.43(1H，dd，2.4 Hz)表明化合物母体为偏三取代苯环，δ 1.73(3H，s)，1.77(3H，s)，4.68(2H，d，6.6 Hz)，5.49(1H，m，6.6，1.3 Hz)是典型的异戊烯氧基信号，δ 9.87(1H，s)结合13C NMR δ 190.9，表明分子中存在一个醛基，根据剩余相对分子质量，容易判断1H NMR δ 5.90(1H，s)为取代在苯上的羟基。在此基础上与文献 ［16］对照数据基本一致，证明化合物4为3-羟基-4-(3-甲基-2-丁烯氧)基-苯甲醛。

化合物5是白色粉末状固体，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.01(2H，d，8.4 Hz)，7.81(2H，d，8.4 Hz)为对位被取代的苯，δ 9.86(s，1H)与化合物4对比，推测为醛基，另一取代基为羟基未出信号，进一步与标准品进行熔点及薄层对照得到确认化合物5为对羟基苯甲醛。

2 实验部分

2.1 试剂与实验仪器

葡萄糖 (CP)、蛋白胨、酵母膏 (BR)、乙酸乙酯 (AR)、石油醚 (AR)、甲醇 (AR)等为市售。结构测定仪器:Bruker AVIII 600 MHz核磁共振仪，VG-2ABB-HS质谱仪。

2.2 菌种及细胞

真菌E33和K38分别为南海红树林麒麟菜和秋茄内分离出的真菌，种属未定，保藏在中山大学化学学院和生命科学学院。

2.3 菌种发酵培养

同时将两株菌等量接种在培养培养基中，菌种发酵培养基的配比及发酵方法同文献 ［2］，共培养120 L。

2.4 分离

发酵液过滤，滤液在50℃下浓缩到5 L，乙酸乙酯提取多次，合并浓缩乙酸乙酯提取液得提取物50 g。提取物经硅胶柱层析，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇梯度淋洗，再经反复柱层析，制备薄层层析和重结晶纯化后得到化合物1(4 mg)，2(15 mg)，3(5 mg)，4(2 mg)，5(2 mg)。

2.5 化合物的物理和波谱数据

化合物 1:C22H28O8，无色针状晶体，MS(FAB pos)m/z:421，403，385，1HNMR(600 MHz，CDCl3)δ:0.89(3H，t，7.2 Hz)，0.97(3H，t，7.8 Hz)，1.25～1.57(8H，m)，1.64(2H，m)，1.70～1.82(2H，m)，1.89(3H，t，7.2 Hz)，2.61(1H，d，15.0 Hz)，2.92(1H，s)，3.02(1H，dd，6.0，13.2 Hz)，3.35(1H，m)，3.49(1H，d，15.0 Hz)，3.71(1H，t，13.2 Hz)，4.72(1H，s)，5.42(1H，s);13CNMR(150 MHz，CDCl3)δ:167.8，167.2，166.2，165.8，146.8，145.3，144.7，142.6，78.3，69.9，43.3，36.3，35.5，32.5，28.8，28.8，25.5，25.5，23.9，23.8，14.4，14.2。

化合物2:C41H77NO9，白色粉末状固体，MS(FAB nega)m/z:726 ［M －H］+。1H NMR(600 MHz，DMSO)δ:8.35(1H，d，8.4 Hz，NH)，5.98(2H，m)，5.25(1H，m)，4.92(1H，d，7.6 Hz)，4.77(1H，m)，4.69(1H，dd，5.4，10.7 Hz)，4.58(1H，m)，4.46(1H，brd，11.5 Hz)，4.31(1H，dd，5.0，11.8 Hz)，4.21(1H，m)，4.02(1H，m)，3.86(1H，m)，2.12(1H，m)，2.03(1H，m)，1.74(1H，brd)，1.62(3H，s)，1.37(1H，m)，1.26(brd，Alphatic －CH2－)，0.86(1H，t，6.9Hz)。13C NMR(125 MHz，DMSO)δ:175.5，135.6，132.2，131.6，124.0，105.3，78.2，78.2，74.9，72.4，72.2，71.5，69.8，62.6，54.5，39.8，35.5，32.9，32.9，31.9，29.8～29.4，28.2，22.8，22.7，15.9，14.2，14.1。

化合物3:C28H48O3，无色针状晶体，MS(ESI pos)m/z:418 ［M+H］+。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:5.67(1H，s)，3.84(2H，m)，3.65(1H，d，8.7 Hz)，3.61(1H，m)，0.93(3H，d，6.8 Hz)，0.88(6H，d，7.2 Hz)，0.75(3H，s)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:138.2，130.0，72.5，71.1， 62.7， 56.9， 55.5， 48.7， 43.2，42.9，41.8， 41.5， 39.8， 39.5， 36.2， 35.7，33.2，31.3， 28.6， 28.1， 26.1， 23.8， 22.8，22.5，21.7，18.8，12.2。

化合物 4:C12H14O3，黄色针状晶体，MS(FAB pos)m/z:207 ［M+H］+，138。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:1.73(3H，s)，1.77(3H，s)，4.68(2H，d，6.6 Hz)，5.49(1H，m，6.6，1.3 Hz)，5.90(1H，s)，6.97(1H，8.4 Hz)，7.41(1H，dd，8.4，2.4 Hz)，7.43(1H，dd，2.4 Hz)，9.87(1H，s)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:190.9，151.2，146.4，139.9，130.6，124.3，118.4，114.1，111.3，66.0。

化合物 5:C7H6O2，白色粉末。1H NMR(600 MHz，CDCl3) δ:7.01(2H，d，8.4Hz)，7.81(2H，d，8.4Hz)，9.86(s，1H)。

［1］林永成.海洋微生物及其代谢产物［M］.北京:化学工业出版社，2003.

［2］丁唯嘉，张杰，黎荣棠，等.两株红树内生真菌混合发酵液提取物抗植物病原菌活性及LC-MS研究［J］.广东化工，2010，37(12):7 －9.

［3］李春远，杨瑞云，林永成，等.海洋真菌K38号代谢产物的研究［J］.中山大学学报:自然科学版，2007，46(1):67－70.

［4］LI C Y，YANG R Y，LIN Y C，et al.A new nonadride derivative from mangrove fungus(strain No.k38)［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2007，9(3):285－291.

［5］李春远，佘志刚，林永成，等.红树林真菌E33代谢产物的分离及衍生物的制备［J］.中山大学学报:自然科学版，2007，46(6):52 －54.

［6］LI C Y，DING W J，SHE Z G，et al.A new biphenyl derivative from an unidentified marine fungus E33［J］.Chemistry of Natural Compounds，2008，44(2):128 －129.

［7］李春远，丁唯嘉，陈敏等，来自红树林内生真菌#E33中的一个新的水杨酸衍生物.中山大学学报:自然科学版［J］.2008，47(1):121－122.

［8］LI C Y，DING W J，SHAO C L，et al.A new diimide derivative from the co-culture broth of two mangrove fungi(strain no.E33 and K38)［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2010，12(9):809 －813.

［9］李春远，佘志刚，林永成，等.红树林内生真菌K38和E33混合发酵代谢产物研究［J］.中山大学学报:自然科学版，2010，49(6):136－138，144.

［10］LI C Y，ZHANG J，SHAO C L，et al.A new xanthone derivative from the co-culture broth of two marine fungi(Strain No.E33 and K38)［J］.Chemistry of Natural Compounds，2011，47(3):382－384.

［11］李春远，张杰，钟嘉升，等.两株红树内生真菌混合发酵培养液中代谢产物的分离鉴定［J］.华南农业大学学报:自然科学版，2011，32(1):117 －119，123.

［12］丁唯嘉，黎荣棠，李春远，等.两株红树林真菌共培养液抗植物病菌成分研究［J］.广东农业科学，2011，38(9):72 －74，77.

［13］ARAI R，SHIMIZU S，MIYAJIMA H，et al.Castaneiolide，abscisic acid and monorden，phytotoxic compounds isolated from fungi(Macrophoma castaneicolaandDidymosporium radicicola)cause"black root rot disease"in chestnut trees［J］.Chemical＆ Pharmaceutical Bulletin，1989，37(10):2870－2872.

［14］胡琳，丁智慧，刘吉开.灰黑拟牛肝菌的化学成分［J］.云南植物研究，2002，24(5):667－670.

［15］徐圆缘，李玲，易杨华，等.块花柳珊瑚化学成分的研究［J］.第二军医大学学报，2010，31(4):421－424.

［16］AYER A W，TRIPONOV S L.Metabolites of peniophora polygonia part 2 some aromatic compounds［J］.Journal of natural products，1993，56(1):85－89.