江西部分地区猪痘病毒PCR检测及P35基因的分析

邓舜洲，蒋新华，冷 闯，朱芝秀，邬向东，戴益民，张文波

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

猪痘病毒（Swinepox virus，SWPV）是痘病毒科（Poxviridae）脊椎动物亚科（Chordopoxvirinae，ChPV）猪痘病毒属（Suipoxvirus）的唯一成员［1］，以引起猪的发热，表皮损伤，形成痘疹和结痂为特征；主要危害4月龄以内的仔猪，发病率可达100%，成年猪呈温和性感染，而且其发病率与饲养环境有关［2］。SWPV具有严格的宿主特异性，猪是该病毒的唯一自然感染宿主。1842年Spinola首次在欧洲发现本病并报道，1960年Kasza L等［3］利用PK-15细胞分离到猪痘病毒；2011年Maria M L等［4］报道巴西某猪场的保育猪暴发猪痘。目前，猪痘呈世界性分布［2］。

由于猪痘对养猪业造成的直接损失较小，虽然也有猪痘病毒感染引起流产或死胎等繁殖障碍的报道［5］，但猪痘临床上主要表现部分猪皮肤出现不同程度的损伤（如水疱、痘痂、局部溃烂等），大部分感染猪能自行康复，因此，猪痘防控工作常被畜牧兽医工作者忽视。猪痘病毒的研究主要集中于猪痘病毒作为表达载体［6-8］。国内也有猪痘病例报道，但仅限于临床诊断［9-11］，未见从分子生物学角度进行猪痘流行病学调查的报道。

本研究根据NCBI登录的SWPV（AF410153.1）P35保守基因序列，设计并合成一对引物，从江西省36个规模化猪场采集疑似猪痘病猪的皮肤痘痂，提取DNA后进行PCR检测，了解江西省猪群中猪痘病毒的感染情况。在此基础上，对江西省部分地区猪痘病毒阳性病料的P35保守基因进行测序，通过对P35基因比对分析，了解江西株之间及其与参考毒株间的亲缘关系，为今后进行猪痘病毒的相关研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000、pEASY-T3Cloning Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；PCR产物胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；JM109工程菌由江西农业大学预防兽医学实验室保存。

1.1.2 病料 55份猪皮肤痘痂为2011年-2012年采集自江西省7个地区（市）共36个规模化猪场中发生明显皮肤痘斑的保育猪（30日龄～70日龄）或母猪，用于测序分析的猪痘病毒阳性病料的背景资料见表1。

1.1.3 引物设计与合成 根据GenBank登录的猪痘病毒（AF410153.1）基因序列，采用Primer5.0软件设计一对扩增猪痘病毒P35基因的引物：

扩增目的片段大小为975bp，上、下游引物分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由Invitrogen （上海）有限公司合成。

表1 猪痘病毒阳性皮肤痘痂来源背景Table 1 The background of swinepox virus positive skin variolar crust in Jiangxi province

1.2 方法

1.2.1 病料中猪痘病毒P35基因的PCR检测 分别取疑似猪痘的皮肤痘痂0.5g剪碎，加入800μL生理盐水匀浆，12 000r／min离心10min，取上清液600μL，按奥斯伯等［12］介绍的方法，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL，其中含10×EasyTaqbuffer 5μL，5U／μL的DNA聚 合 酶 0.5 μL，2.5mmol／L dNTPs 4 μL，20μmol／L的上下游引物各0.5μL，模板2μL，ddH2O 37.5μL。PCR反应条件为：95℃5min；95℃45s，54℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸8mim。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳，胶回收扩增产物，送Invitrogen（上海）有限公司测序。

1.2.2 P35基因的克隆及测序 按照天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化，回收产物与pEASY-T3克隆载体连接，转化至感受态JM109宿主菌，筛选阳性重组菌。挑取单个菌落送Invitrogen（上海）有限公司进行测序。

1.2.3 序列分析及系统发育树绘制 将测序得到的P35基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank登录的序列进行比较，利用DNA Star软件中的MegAlign进行P35基因核苷酸序列的同源性和变异分析，并构建相应的系统发育进化树。

2 结果

2.1 病料的PCR扩增结果

从55份疑似猪痘的猪皮肤痘痂中提取DNA，经PCR扩增，电泳后可见部分病料（44／55）扩增出与预期大小一致的单一条带，而正常猪皮肤（无痘斑）则未见扩增条带（图1）。结果表明以上7地区的部分猪群中存在猪痘病毒的感染。

图1 病料PCR扩增结果Fig.1 PCR results of skin vesicles

2.2 P35基因序列分析结果

对其中19份PCR产物进行测序、分析，结果表明所测序列与SWPV参考毒株（登录号：AF410153.1）的P35序列核苷酸同源性为96.3%～98.4%，推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%；所测序列间的核苷酸同源性为97.7%～100%，推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%（图2）。

2.3 系统进化分析

利用DNA Star软件构建P35基因序列的分子进化树（图3）。共分成两个大的分支，其中SWPVJX03、SWPV-JX04和SWPV-01自成一个分支，与参考毒株（AF10153.1）亲缘关系最远；其他与参考毒株组成一个大的分支，其中与参考毒株亲缘关系最近的是SWPV-JX07和SWPV-JX08；各阳性病料之间的同源性都很高。

图2 P35基因核苷酸序列同源性比较Fig.2 Nucleotide identity of nucleotides from SWPV-JX P35gene

图3 P35基因核苷酸序列分子进化树Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotides from SWPV-JX P35gene in Jiangxi province

3 讨论

欧洲、北美和大洋洲均有暴发猪痘的报道，还有先天性感 染 SWPV 的 报 道［2，13-14］。2010年-2011年，巴西圣保罗的3个养猪场共3 460头猪有850头出现皮肤脓疱、丘疹症状，最后结痂，利用分子生物学方法确定该病原为SWPV［4］。国内安徽、黑龙江等也有关于猪痘病例的报道，发病猪主要集中在保育到育肥阶段［9-11］，但仅限于临床诊断，均未从分子生物学方面进行研究。

SWPV的全基因组序列测定已完成，其基因组大小约为146kb，含有150个开放阅读框（ORF）。其中P35基因编码猪痘病毒胞内成熟病毒粒子（IMV）囊膜表面的一个主要结构蛋白P35，其同源基因也存在于其他痘病毒属，且具有高度保守性［1］，推测其在猪痘病毒中也具有保守性，可用于猪痘病毒的检测和分析。国外Olivia等利用P35保守基因的同源基因进行痘病毒属之间的亲缘关系比较分析。

近年来，在江西部分地区的规模化猪场的保育仔猪常出现疑似SWPV感染的皮肤痘疹样病变，为了解其病原和感染情况，本文利用PCR方法从收集的55份样品中检测到44份阳性病例，阳性率达80%，证实江西省部分地区猪群中存在猪痘病毒感染。随机取19份PCR产物进行测序和序列分析，结果所测的序列与SWPV参考毒株的核苷酸同源性为96.3%～98.4%，推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%；所测的19条序列之间的核苷酸同源性为97.7%～100%，推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%。表明本次扩增的基因均为SWPV的P35基因序列，与参考毒株的相应序列相比，变异度不大，保守性较强，可用于SWPV的分子流行病学调查和作为SWP诊断的靶标。

本试验从江西部分规模化猪场采集可疑猪痘病毒病料，进行PCR检测，并对部分PCR产物进行序列测定和分析，并分析比较了地方毒之间、地方毒与国外分离毒之间P35基因变异情况，为江西省猪痘病毒的诊断、预防及流行病学研究积累了基础资料。

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