绵羊肺腺瘤kras 和其他相关基因突变的检测

周艳喜，于立新，张月梅，敖威华，朱富余，么宏强，马学恩＊

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2.内蒙古出入境检验检疫局，内蒙古呼和浩特010020）

ras基因最初在大鼠肉瘤组织基因组中发现，kras定位于第12号染色体上，含4个编码外显子和1个5′端非编码外显子，编码由189个氨基酸组成的Ras蛋白，因其分子质量为21ku，又称为p21蛋白，Ras蛋白在细胞增殖分化信号从激活的跨膜受体传递到下游蛋白激酶过程中起重要作用。在多数人类肿瘤组织基因组DNA中均可以检测到ras基因突变，其中在肺癌、胰腺癌和结肠癌组织中最常见。ras基因家族包括3个密切相关的成员，分别为kras、hras、nras基因，其中kras基因与肺癌的关系最为密切［1-2］。pik3ca基因具有调控机体细胞增殖、分化等许多重要的生理功能，在人脑、肺、胃肠等组织中均有表达。pik3ca基因突变与肿瘤的关系和致瘤机制的研究已成为目前肿瘤研究的热点［3-5］。pik3ca的突变4／5发生在螺旋区和激酶区这两个区域，其突变可以减少细胞的凋亡，还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶PI3Ks的活性。大多数细胞中都存在EGFR，包括所有的表皮细胞、部分神经胶质细胞基质细胞和平滑肌细胞。EGFR激活的下游信号转导通路中包含许多调控蛋白，对细胞增殖、凋亡、血管生成具有重要的调控作用。在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、浸润、预后差有关［6］。p53基因突变与人类肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌等肿瘤有关。人类肿瘤中p53基因突变主要发生在高度保守区内，其中175、248、249、273、282密码子的突变率最高，不同种类肿瘤突变位点和突变率不同。

从分子水平对癌症相关基因进行突变检测，是癌症患者靶向治疗和化疗药物选择的辅助参考依据［7］，KRAS、EGFR（表皮生长因子受体）已经成为肿瘤分子靶向治疗的公认靶点。单个氨基酸突变在持续激活突变中具有重要的生物学意义，与导致的多种恶性肿瘤密切相关，根据己有的研究成果和存在问题，本研究使用PCR-SSCP法检测绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）病羊egfr、kras、pik3ca基因突变，期望为绵羊肺腺瘤病毒（Ovine pulmonary adenomatosis virus，OPAV）致病机理的研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准阳性病料基因组DNA 病羊肺脏组织由内蒙古农业大学兽医学院病理生理实验室检测确定感染了绵羊肺腺瘤病毒并保存。阴性对照组织采自呼和浩特市某羊场经鉴定未感染绵羊肺腺瘤病毒。

1.1.2 试剂 LA Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL 15 000、pMD18-T等为宝生物工程（大连）有限公司产品；Tissue／Blood DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 确定 nras、kras、pik3ca、egfr、p53基因中突变高的位点。设计引物扩增nras、kras、pikca、egfr、p53基因突变频率高的位点所在外显子（表1和表2）。

表1 kras、nras、pik3ca、egfr和p53外显子扩增引物Table 1 PCR primers of kras，nras，pik3ca，egfr and p53

表2 kras、nras、pik3ca、egfr和p53外显子基因检测位点Table 2 Mutational sites needed to detection in kras，nras，pik3ca，egfr and p53

1.2.2 绵羊基因组DNA的提取 根据天根公司Tissue／Blood DNA提取试剂盒的操作步骤提取各样品基因组DNA，10g／L琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，经分光光度计检测DNA浓度纯度后置-80℃冰箱保存。

1.2.3 目的基因的PCR扩增 以提取的OPA病羊基因组 DNA 为模板，以 NRAS1F／NRAS1R、NRAS2F／NRAS2RKRAS1F／KRAS1R、KRAS2F／KRAS2R、PIK3CA9F／PIK3CA9R，EGFR17F／EGFR17R、EGFR20F／ EGFR20R、P536F／ P536R、P537F／P537R为引物进行PCR扩增。反应体系为25μL：LATaqDNA聚合酶0.25μL，dNTP 4μL，LA buffer 2.5μL，灭菌水15.25μL，上、下游引物各1μL，模板基因组DNA 1μL。反应参数为：94℃预变性5min；94℃30s，退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃终止反应，产物进行20g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 SSCP法检测基因突变 PCR扩增目的片段，20g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物中是否有非特异性扩增产物。取3μL PCR产物与3μL SSCP上样缓冲液混合，12 000r／min离心30s。将样品于PCR仪上95℃变性10min，立即将PCR产物置于冰上静置5min。300V电泳30min后恒温110V继续进行SDS凝胶电泳电泳10h。取出凝胶用去离子水洗2次，浸入100mL／L乙醇、5mL／L冰醋酸混合溶液中固定6min，用去离子水洗2次，再浸入10mL／L AgNO3溶液中染色10min，用去离子水洗3次～5次，然后浸入15g／L NaOH、4mL／L甲醛混合溶液中显色。于成像系统中观察、拍照，对结果进行分析。

1.2.5 测序结果分析 PCR-SSCP结果阳性样品送北京三博志远生物技术有限公司进行测序，应用生物软件DNA Star、CLUSTAL对测序结果进行分析。

2 结果

2.1 nras、kras、pik3ca、egfr和p53基因目的外显子扩增

以标准阳性病料和阴性对照组绵羊基因组DNA为模板扩增 nras（exonl，2）、kras（exonl，2）、pik3ca（exon9）、egfr（exonl7，20）、p53（exon6，7）目的片段。基因编码序列长分别为128／179、111／179、120、123／54、109／137bp（图1）。扩增的片段大小与理论大小一致，测序结果显示扩增的基因片段为目的序列。扩增的目的片段没有杂带，可以用作模板进行SSCP检测。

图1 目的片段扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of objective genes

2.2 SSCP检测结果

SSCP与测序分析显示扩增的片段nras（exonl，2）、kras（exon2）、pik3ca（exon9）、egfr（exonl7，20）、p53（exon6）未发生突变。kras（exon1）检测检测到突变，p53（exon7）检测到突变。

2.2.1 kras第1外显子检测 SSCP图2显示样品2、5PCR产物的单链构象多态性与阴性对照不同，样品1、3、4的单链构象多态性与阴性对照相同，外显子的测序峰图显示kras（exon1）杂合型突变，外显子核苷酸突变：35G→T（第35位核苷酸由G突变为T），编码的氨基酸位于第12密码子：G12→V（第12位氨基酸由G即甘氨酸突变为V即缬氨酸）。

2.2.2 p53第7外显子检测 引物P537F／P537R PCR扩增基因p53（exon7），PCR产物电泳结显示137bp的条带，绵羊与人P53在氨基酸和核苷酸水平上有很高的同源性以人p53基因第7外显子表示绵羊突变位点阳性样品p53（exon7）检测出突变，核苷酸突变：825T→C（图3），编码的氨基酸未发生突变，依然是C即半胱氨酸。

图2 kras exon1SSCP检测结果Fig.2 Detection results of kras exon1by SSCP

图3 p53exon7SSCP检测结果Fig.3 Detection results of p53exon7by SSCP

3 讨论

绵羊肺腺瘤是由绵羊肺腺瘤病毒引起的一种成年绵羊慢性、进行性、接触传染性肺脏疾病，以潜伏期长，咳嗽，呼吸困难，大量浆液性鼻漏，瘦弱，肺泡和支气管上皮进行性肿瘤性增生和死亡率高等临床和病理变化为主要特征［8-9］。研究发现OPAV通过RAS／RAF／MAPK和PI3K／AKT两种不同机制恶性转化细胞［10］。

筛选单碱基突变有一系列的方法包括PCR-SSCP，等位基因竞争性抑制PCR，以及“TaqMan”法基因分型。每种方法有其独特的优点或不足［11］。这些方法的不足之处在于竞争性抑制和TaqMan法只能检测特定的突变。TaqMan需要相对昂贵的探针用于显示结果。PCR-SSCP需要PCR处理后产物，是一种常用的检测方法，即使单链中出现单个碱基的改变也能够检测出来。但同时也不能排除检测方法和标本处理过程对结果的影响。

作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因。ras基因激活的方式有3种，即基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中ras基因被激活最常见的方式就是点突变，多发生在N端第12、13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT突变成GTT［12］。学者采用定点突变技术，对hras基因第12位密码子一甘氨酸的所有置换氨基酸的可能性进行了分析，结果表明，此位点上，除置换氨基酸为脯氨酸外，其余的置换氨基酸均具有转化潜能，但有程度差异。本试验10个阳性样品中检测出2个kras基因第一外显子突变样品，核苷酸突变为点为35G→T，编码的氨基酸位于第12密码子12G→V。不同突变位点对P21的活化机制不同，第12密码子突变可以减弱P21内在的GTP酶活性，并使细胞凋亡减少、细胞间接触抑制减弱。kras基因发生突变时，导致编码的氨基酸发生改变，鸟苷三磷酸酶（GTPase）活性降低，p21GTP牢固结合而不被GTPase水解，一直处于激活状态，信号传递持续开放，刺激细胞不断生长、发育、增殖，最终导致细胞的癌变。kras基因突变在患病绵羊肺脏肿瘤组织中被发现，推测kras基因突变可能与肺肿瘤的形成过程存在一定的关系。

野生型p53基因是一种抑癌基因。引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。一系列的方式能使P53失活，在一些肿瘤中无义突变造成p53翻译中断。最常见的是错义突变，野生型与突变体形成更稳定的四聚体，使蛋白丧失正常功能，p53基因突变后由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA修复的调控作用，p53基因由抑癌基因转变为癌基因。实验结果提示，正常绵羊基因组为野生型，一例阳性样品检测出P53突变，CDS突变825T→C，氨基酸未发生突变，不改变蛋白的结构，可能在OPA致病过程中不起作用。

近年发现OPAV通过RAS／RAF／MAPK和PI3K／AKT两种不同机制恶性转化细胞［3］。有研究表明 H／N-RAS-MEK-MAPK信号通路在OPAV转化细胞过程中是非常重要的。有必要从基因突变方面对OPAV转化细胞的过程进行探讨。

目前国外有关人类突变频率与癌症的关系的研究很多，学者们对人类这些基因突变，以及基因突变对编码蛋白功能的影响已经有了比较深入的研究。本研究借鉴人类肺癌与基因突变关系的研究，对OPA与基因突变的关系进行了探讨，本研究在OPAV感染绵羊的组织中检测到kras基因突变，说明kras基因突变和肿瘤的形成可能存在一定的联系。但对致病机制的探讨还需要更深入研究。本研究中kras（exon 2）、nras（exonl、2）、pik3ca（exon 9）、egfr（exonl7、20）、p53（exon6）均未检测出突变。但也不能排除检测样本的储存处理等结果产生的影响。

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