猪圆环病毒2型吉林分离株全基因组的克隆与序列分析

杨博超，王凤雪，温永俊，李建喜，杨志强，武 华＊

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）是断乳仔猪多系统衰竭综合征（Post－weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，该病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒直径17nm左右，为已知的最小的动物病毒之一[1－2]。患PMWS的猪于1991年在加拿大西部首次发现，并已在世界范围内流行，给养猪业带来极大的经济损失[1，3－4]。PMWS的症状主要表现为生长缓慢、贫血、呼吸困难、黄疸等，病理变化包括肉芽肿性间质性肺炎，淋巴结肿大，肝炎和肾病[3]。有研究表明，自然发生PMWS猪的肝炎致病机理与PCV－2感染导致的细胞凋亡有关[5]。

PCV－2基因组为共价闭合的环状单链DNA，以滚环方式进行复制[6]。目前在GenBank上发表的各毒株基因组长度介于1766bp和1769bp之间。不同地区的PCV－2毒株基因组有一定差异，且近年来有关PCV－2遗传变异情况的报道不断增多[7－10]，故对PCV－2地方株的分离及基因组序列分析有助于了解该地区的PCV－2分子流行病学特征，确定其致病特性和变异情况。本研究从吉林采集的疑似PMWS病死猪体内分离出一株PCV－2，为其相关病原学研究提供了材料，对此分离株进行了全基因组扩增测序及序列分析，为PCV－2的地区分布差异及变化规律研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及病料样品 PK－15细胞由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室保存；病料来自吉林某猪场疑似PMWS病死猪的组织（包括肺、脾、淋巴结）。

1.1.2 试剂 PCR试剂（包括 ExTaq酶、dNTP Mixture、10×ExTaq buffer）、DL 2000Marker、克隆载体pMD 18－T Vector，为宝生物工程（大连）有限公司产品；氨苄青霉素（Amp）和无水乙醇为北京化学试剂公司产品；感受态细胞宿主菌E.coli DH5α由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室保存；DNA提取试剂盒为BioTeke生物技术有限公司产品；DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒为Axygen（杭州）生物技术有限公司产品；D－氨基葡萄糖购自Sigma公司。胎牛血清（FBS）、高糖DMEM干粉为Gibco公司产品；FITC标记的PCV－2抗体为美国VMRD公司产品；其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 引物 参照文献[11]合成1对引物，可扩增PCV－2的全基因组。引物序列为：F－PCV－2－SacⅡ：5′－GAA CCG CGG GCT GGC TGA ACT TTT GAA AGT－3′；R－PCV－2－SacⅡ：5′－GCA CCG CGG AAA TTT CTG ACA AAC GTT ACA－3′。引物由Invitrogen（北京）公司合成，为冻干粉，用前溶于灭菌的超纯水中，稀释至100μmol／L，工作浓度为20pmol／μL，置－20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 取猪淋巴结剪碎研磨后冻融3次、离心，上清过0.22μm滤膜除菌，处理后接种于长至半融合状态的PK－15细胞上，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下孵育1h后弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次，加入维持液，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养24h，按文献[12]方法进行D－氨基葡萄糖处理，继续培养48h，收获培养液，并反复冻融3次。按上述方法连续盲传3次后，收获培养物备用。

1.2.2 分离病毒鉴定 用免疫荧光方法，首先将上述分离的盲传细胞培养物接种于半融合状态的PK－15细胞（96孔板），设重复4孔，同时设阴、阳性对照，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，72h后弃去维持液，用PBS洗涤3次，每次5min，冷丙酮固定细胞，100μL／孔，4℃30min，弃丙酮，室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入FITC标记的PCV－2抗体（PCV－2阳性血清），50μL／孔，37℃避光孵育1h；移去孔内液体，PBS洗涤3次，每次5min，在荧光显微镜下观察。

1.2.3 全基因组扩增 将PK－15细胞盲传培养物用核酸提取试剂盒提取病毒的总DNA，用设计的引物进行PCR鉴定。PCR反应体系为：10×ExTaq buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，上下游引物各1μL，DNA模板5μL，ExTaq酶0.5μL，加重蒸灭菌水补至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸7min。取PCR产物于10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下，迅速切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1.5mL的Eppendorf管中，以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，电泳鉴定回收的PCR产物。

1.2.4 PCV－2全基因组测序 将纯化回收的PCR产物连接到pMD 18T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取经PCR初步鉴定为阳性的重组菌，扩大培养并提取质粒，进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆。经鉴定正确后，送Invitrogen（北京）公司测序，并进行后续分析。

1.2.5 PCV－2系统发育分析 将测序结果用NCBI／BlAST在线工具查找GenBank上已登陆的与其有较大相似性的序列。根据BLAST结果，选择部分参考序列，进行序列相似性分析。应用MEGA4绘制系统进化树，对所选PCV－2全序列进行分析。序列的多重比对使用Clustal W方法，在绘制系统进化树的过程中使用邻接法。

2 结果

2.1 分离病毒荧光染色结果

将分离培养物感染PK－15细胞后，经FITC标记的PCV－2阳性抗体染色，在荧光显微镜下观察，可见感染细胞的细胞浆内和胞核内均有较强绿色荧光，而细胞对照孔则未见到特异性荧光（图1）。

荧光染色结果表明已经分离到PCV－2病毒，并可被PCV－2抗体特异性识别。将此病毒分离株命名为PCV－2－JL11S。

图1 分离病毒免疫荧光检测Fig.1 Immunofluorescence detection of isolated virus

2.2 全基因组PCR扩增结果

全基因组扩增产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外成像仪下观察，结果如图2显示。电泳结果显示PCR扩增出1800bp左右的特异性片段，与预期片断大小相符。

图2 PCV－2－JL11S株的全基因组扩增产物电泳图Fig.2 The electrophoresis of complete genome amplification product of PCV－2－JL11Sstrain

2.3 测序结果及序列分析

将PCV－2全基因组克隆阳性菌液进行测序，将测序所得序列拼接，结果显示，PCV－2－JL11S株全长1767bp，分析分别包含编码Rep和Cap蛋白的ORF1和ORF2。应用BLAST工具对测得序列进行比对，选14株已提交到GenBank的PCV－2全基因的核苷酸序列，应用DNA Star将测得序列与已知PCV－2序列进行比较（所选14株PCV－2全基因序列的GenBank登录号分别为HM776439、HQ395054、EU148503、HQ395032、HQ395042、HQ395033、HQ395037、HQ395040、AY177626、PCV－2－JL11S、HQ395057、HQ395035、HQ395047、HQ395039、HQ395046）。

分析结果表明，所比对的全部PCV－2毒株之间相似性很高，介于94.4%～99.8%之间。本试验所测定的PCV－2－JL11S毒株与HQ395035株及HQ395057株之间相似性最高，达到99.2%。

2.4 系统进化树分析

为了更好地了解PCV毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，利用MEGA软件对上述15株PCV－2病毒全基因组序列绘制了系统发生进化树（图3）。

图3 PCV－2吉林分离株及其他14株PCV－2全基因组系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the complete genome of PCV－2Jilin strain and other 14strains

从图3可以看出，PCV－2分成多个分支，欧洲测定株EU148503自成一支，其余14株PCV－2均为国内分离株，但也分为多支。本试验分离PCV－2－JL11S株与HQ395057关系最近。

3 讨论

近年来，PMWS对世界养猪业影响严重，PCV－2在该病的发病中扮演重要角色。世界各国针对PCV－2的研究很多，但目前PMWS的发病机理仍不明确[13]。有研究指出，不同的基因型在致病性方面也有差异[14]，故分离不同PCV－2毒株为其致病机理研究奠定了基础。本研究从疑似PMWS的病料中分离出一株PCV－2，并一次性扩增出了该分离株的全基因组序列且进行了测定，此方法避免了分段扩增的麻烦及拼接错误等不利因素的影响，提高了试验的精确性和准确度。

本试验分离得到的PCV－2吉林毒株与其他地区毒株的相似性很高，最高可达99.2%，说明比对用所有PCV－2毒株之间亲缘关系都很近，进化上比较保守。通过系统发育进化树可以看出，本试验分离株与HQ395057株亲缘关系较近，处于同一分支内。但与2009年吉林PCV－2测序株（HQ395037）在进化关系上较远，是由于PCV－2基因变异导致还是由于外源污染物感染导致尚不明确，需进行深入研究。分析结果表明，目前吉林地区PCV－2毒株存在变异，虽然变异程度不大，但这提示我们在PCV－2所导致的疾病预防控制过程中要对其基因变异情况时刻关注，并深入分析其变异根源。

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