河南省部分地区猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒核酸检测分析

宋宏晓，李葱晓，王 慧，张明亮，张春杰

（1.洛阳市动物疫病预防控制中心，河南 洛阳 471002；2.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003）

神经症状是兽医工作者在临床诊断中经常遇见的一类动物发病症状，畜禽感染某些疫病时伴有特殊的神经症状，这些特殊的神经症状能作为示病症状，对疫病的诊断有着重要的意义[1－2]。随着近年来养猪规模的不断扩大，引起猪神经症状疫病的危害越来越大，有些繁殖母猪所生产的仔猪会表现先天性震颤，严重影响仔猪的正常生长。猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）、猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）、猪瘟（Classical swine fever，CSF）、猪流行性乙型脑炎、猪链球菌病和一些猪中毒病等是目前报道的猪常见的具有神经症状的疾病。PR是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起一种伴有严重神经症状且以母猪的繁殖障碍、仔猪的高死亡率为特征的免疫缺陷性传染病，也是目前严重影响我国养猪业发展的重要疫病之一[3－4]。PCVD是近20年来发现的由2型圆环病毒（PCV－2）引起的一种以仔猪多系统衰竭综合征为主要特征的免疫缺陷性疫病，主要表现为呼吸困难、消瘦、体表淋巴结肿大和神经症状等。CSF是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种热性高度接触性且以高死亡率为特征的免疫缺陷性疫病，少数病猪出现惊厥、痉挛等神经症状[5]。这3种病都是目前国内常见的猪传染病，发病时都可能会伴有神经症状，并表现母猪的繁殖障碍，而且一旦感染后都会损害猪体的免疫器官，造成免疫缺陷，导致其他传染病的继发，并在临床上常呈混合感染。

近年来，这3种引起猪神经症状的免疫缺陷性疫病的单一感染日渐减少，混合感染日趋严重[6]，给养猪业造成了严重的危害，同时由于类似发病症状给诊断工作带来了困难，预防和控制该类疫病面临着更加严峻的挑战。本研究对采集自豫西地区的具有明显神经症状发病猪的病料应用RT－PCR和PCR技术进行PRV、PCV－2、CSFV 检测，以了解猪群中 PR、PCVD和CSF等3种伴有神经症状的免疫缺陷性疫病的感染情况，为河南省部分地区该3种猪病的诊断和防控积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料收集 2010年10月至2012年3月，在河南省平顶山、三门峡、焦作、洛阳等市动物疫病预防控制中心，无菌收集来自各县市具有明显神经症状发病猪的样本共84份，样品包括扁桃体、淋巴结、脾脏、肺脏等组织，于－20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒购于Bioteke poration公司；AMV反转录酶、2×Taq PCR Master Mix、DNA Taq 酶、dNTP Mixture、DL 2000／1000DNA Marker等购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank公布的基因全序列设计3对分别用以扩增PRV、PCV－2、CSFV的特异性引物，其中PRV选取了gD基因，PCV－2选取了ORF2基因，CSFV选取了E2基因上相对保守的序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。

1.2.2 病料的处理和RNA的提取 取0.5g左右的脾及肺脏置于匀浆器中，剪碎病料，并加入1mL DEPC处理的灭菌双蒸水，于冰浴中匀浆处理后转移至1.5mL EP管中，－70℃反复冻融3次，5000r／min离心5min，取上清置－20℃储存备用。按RNA提取试剂盒操作说明书提取病料组织中的病毒RNA。

表1 所用引物Table1 Primers used in this study

1.2.3 病料的处理和DNA的提取 按DNA提取试剂盒（离心柱型）操作说明书处理病料（肺脏和脾脏）并提取病毒DNA。

1.2.4 PCV－2与PRV的检测 以病料中提取的病毒DNA为模版，应用PCR扩增PCV－2与PRV部分基因片段。PRV的PCR反应参数如下：94℃预变性5min；94℃30s、48℃30s、72℃ 45s，共34个循环；最后72℃延伸10min。PCV－2的PCR反应参数如下：94℃预变性5min；94℃30s、65℃30s、72℃30s，共34个循环；最后72℃延伸10min。10g／L琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，前者PRV的目的条带为220bp，后者PCV－2的目的条带为650bp。

1.2.5 CSFV的检测 以病料中提取的病毒RNA为模版，用AMV反转录酶和2×Taq Master Mix采用两步法扩增CSFV目的基因片段。RT反应参数：42℃50min，99℃5min，5℃5min。PCR反应参数：94℃预变性5min；94℃30s、57℃30s、72℃40s，共34个循环；最后72℃延伸10min。10g／L琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，目的条带为280bp。

1.2.6 结果判定 根据检测结果，结合病料背景，特别是其临床症状和免疫情况，最终判断该病料是否发病。

2 结果

2.1 PRV、PCV－2和CSFV核酸片段检测结果

应用RT－PCR和PCR的方法，对收集自河南部分地区的84份有明显神经症状猪的病料样本进行PRV和PCV－2的PCR及CSFV的RT－PCR检测。结果PRV阳性63份，阳性率为75.00%，部分阳性样本结果见图1；PCV－2阳性51份，阳性率为60.71%，部分阳性样本见图2；CSFV阳性27份，阳性率为32.14%，部分阳性样本见图3；而无以上任何病原的样本仅占了总样本的7.14%。表明该地区存在PR、PCVD和CSF这3种伴有神经症状的猪免疫缺陷性疫病的流行；同时在这3种伴有神经症状疫病中以PR发病为主。结果见表2。

图1 部分病料PRV基因PCR扩增结果Fig.1 PCR products of part samples for PRV gene

2.2 PRV、PCV－2和CSFV单独感染统计结果

统计84份样本中单独感染的样本，结果见表3。从表3可以看出，PRV单独感染21份，感染率25%；PCV－2单独感染3份，感染率为3.75%；CSFV单独感染3份，感染率为3.75%。表明在这3种伴有神经症状的免疫缺陷性疫病中，单独感染以PR感染率较高。

2.3 PRV、PCV－2和CSFV混感检测结果

PRV、PCV－2和CSFV混感检测情况见表4。从表4可以看出，豫西地区PRV、PCV－2和CSFV相互之间总混感51份，总混感率为60.71%；二重混感中PRV／PCV－2混感型混感27份，PRV／CSFV混感型混感3份，PCV－2／CSFV 混感型混感9份，PRV／PCV－2／CSFV混感型混感12份，二重混感率分别为32.14%、3.57%、14.29%；三重混感率为14.29%。表明该地区存在PRV、PCV－2和CSFV 3种猪神经症状免疫缺陷性疫病的混合感染，且混感程度较深，总混感率达60.71%；在不同的混感型中，以PRV／PCV－2混感型最严重。

图2 部分病料PCV－2基因PCR扩增结果Fig.2 PCR products of part samples for PCV－2gene

图3 部分病料CSFV基因R－T PCR扩增结果Fig.3 RT－PCR products of part samples for CSFV gene

表2 PRV、PCV－2和CSFV检测结果Table2 Detection results of PRV，PCV－2and CSFV

表3 PRV、PCV－2和CSFV单独感染检测结果Table3 Detection results of single infection with PRV，PCV－2and CSFV

表4 PRV、PCV－2和CSFV混感检测结果Table4 Detection results of mixed infections with PRV，PCV－2and CSFV

3 讨论

据报道，PR、PCVD和CSF都可能伴有神经症状，尤其以PR最为明显。目前，对于这3种疫病的研究主要集中在引起母猪繁殖障碍、免疫缺陷机理、疫苗防控、混合感染、诊断方法等[7－9]，而对其伴有的神经症状报道内容浅，大多是有关鉴别、诊断和治疗。同时，PR、PCVD和CSF现均已成为严重影响我国养猪业发展的重要的疫病，对养猪业危害巨大。为此，本研究对采集于豫西地区的伴有明显神经症状猪的病料应用RT－PCR和PCR方法进行PRV、PCV－2、CSFV核酸检测，以了解猪群中PRV、PCV－2和CSFV 3种伴有神经症状的免疫缺陷性疫病的感染情况，为河南省部分地区神经症状疫病的诊断和防控积累资料。

3.1 PRV、PCV－2和CSFV阳性情况

通过对84份伴有神经症状的病料样本进行检测，结果表明该地区存在伴有神经症状的这3种猪病的流行，且PR和PCV－2阳性率较高，都超过了50%（75.00%和60.71%）；在这3种伴有神经症状的疫病中，PR阳性率达75.00%，与陶顺梅2011年的研究结果相符[10]。

3.2 PRV、PCV－2和CSFV单独感染情况

对84份伴有神经症状的病料样本检测后统计发现，该地区存在这3种疫病的单独感染，尤以PRV最为严重。单独感染时，PRV的单独感染率相对较高达25%。与其他省市有差别[11－13]，这可能与河南省的养殖规模和养殖密度较大有关。前些年，猪伪狂犬病疫情相对稳定，呈散发性流行，另外猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗的广泛应用，有效阻止了该病毒的感染。本研究发现PCV－2和CSFV的单独感染率都是3.57%，比较低，这可能与该地区疫苗的合理应用有关。另外，该地区的PR单独感染率较高，除了跟地区差异因素有关外，与这一地区养猪户对于猪伪狂犬病疫苗接种和猪场管理还不够重视也不无关系。该地区的PR单独感染率较高，除了跟地区差异因素有关外，与这一地区养猪户对于猪伪狂犬病疫苗接种和猪场管理还不够重视也不无关系。

3.3 PRV、PCV－2和CSFV混和感染情况

统计PRV、PCV－2和CSFV的混合感染情况，结果表明该地区存在PRV、PCV－2和CSFV 3种伴有神经症状疫病的混合感染，且混感比例较高，其总混感率达60.71%，混感方式多样，具有 PRV／PCV－2、PRV／CSFV、PCV－2／CSFV 和 PRV／PCV－2／CSFV 4种混感型；在不同的混感型中，以PRV／PCV－2混感型最严重。这为临床兽医工作者诊断提供了方向，当根据神经症状与其他临床特征可以明显确诊其为PR混感时，首先可以考虑是否为PRV与PCV－2的二重混合感染。在多病原感染中猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪圆环病毒病之间二重或多重感染也很常见。杨汉春等[14]对近年来不同地区规模化猪场死亡猪只57份病料的检测，结果显示，二重感染PRV／PCV－2占14.00%，该地区与之相比混感率较高。

3.4 PRV、PCV－2和CSFV单独感染与混合感染对比

PRV、PCV－2和CSFV单感与混感情况对比发现，豫西地区的总混感率比总单感率高，这与当前的猪病流行特点相符。但是，PRV的单感率比PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 3种混感型的混感率都要高，认为这与PRV这种病本身不无关系。本研究采集的病料样本是伴有神经症状猪的，而PR是由猪伪狂犬病毒引起的一种初生仔猪伴有神经症状，病程短，病死率极高的传染病[15]。因为伴有神经症状的PR病发于仔猪的出生阶段，而且病程短，所收集病料的猪缺少继发PCVD和CSF这时间过程，所以PRV的单感率比3种混感型混感率都高与该病本身有关。然而出生3d的仔猪却易发PCVD，同时在该阶段存在母猪的疫苗接种不到位而导致小猪体内抗体滴度低这种可能，所以易造成PR与PCV－2混合感染。

PR、PCVD和CSF 3种伴有神经症状的免疫缺陷性疫病，对目前的养殖业带来了巨大的危害。既可以造成繁殖障碍，又可以引起免疫缺陷，导致疫病的混合感染。本研究通过对84份采集豫西地区伴有神经症状的病料样本检测，统计它们的阳性情况、单感情况、混感情况以及单感与混感的对比情况，分析发现，该地区存在这3种伴有神经症状疫病的流行，包括单感流行和混感流行；单感中以PRV为主要流行，混感中以PRV／PCV－2这种混感型为主要流行；混感复杂，具有 PRV／PCV－2、PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 4种混感型；混感总混感率比单感总单感率高，而PRV的单感率比PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 3种混感型的混感率却都要高。

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