副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展

马广鹏

（中国农村技术开发中心，北京100045）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，是一种具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的不能运动多形性小杆菌，能引起猪的多发性纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎［1］。近年来，H.parasuis的感染引起了猪的高发病率和高死亡率，已给养猪业带来了巨大的经济损失。另一方面，H.parasuis是猪上呼吸道的常在菌，能从假定健康猪的鼻腔和上呼吸道中分离［1］。由于菌株毒力的差异，急性和慢性病例临床特征也存在很大的差异［2］。对H.parasuis毒力因子的鉴定是深入研究其致病机制和对制定更有效的H.parasuis感染的防控策略具有重要意义。

H.parasuis血清型通常被认为是毒力的一个指征。用血清分型方法可将H.parasuis分为15个血清型［2］，但有很大比例的临床分离菌株不能确定其血清分型。通过腹腔注射感染SPF猪，将15个血清型的毒力划分为能高发病率和高病死率的强毒力血清型菌株，能引起多发性浆膜炎而死亡的中等毒力菌株和不引起任何临床症状的无毒力菌株。但也有研究发现，同一血清型的菌株毒力存在很大的差异，因此，血清型和毒力之间似乎没有确切的相关性。

通过基因遗传操作构建突变株是从分子水平上阐明基因功能的重要手段之一。细菌通常遗传操作方法有结合转移、转导和自然转化。自然转化是细菌通过同源重组的方法有效将大分子DNA摄取和重组到宿主基因组上的过程。Bigas A等［3］建立了一种具有环腺苷酸（cAMP）依赖性自然转化系统。Zhang B等［4］在此基础上对该系统进行改造，建立了以SC096为模式菌株的一种不需要依赖cAMP新的自然转化方法。利用该系统构建了一系列基因缺失株，对基因功能和毒力因子的进行了深入的研究。另外，有些研究者则通过在体外模拟细菌感染的环境来发现H.parasuis的毒力因子［5-9］。也有研究者通过与巴斯德菌科其他细菌的已知毒力因子序列比对，在基因组水平上鉴定H.parasuis潜在的毒力因子［10-13］。随着H.parasuis全基因组序列的释放，并结合遗传操作系统的建立和传统功能基因分析方法的运用极大的促进了毒力因子和致病机制的研究。本文对H.parasuis毒力因子的研究进展进行综述。

1 副猪嗜血杆菌毒力因子

副猪嗜血杆菌毒力因子包括外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）。在革兰阴性菌中，外膜是保证细菌能够在不同生存环境中定殖和生存的重要结构。鉴于独特的成分和物理特性，外膜作为一个选择的“分子筛”能够阻挡很多的有毒分子进入细胞，对于细菌的生存是至关重要的。同时，外膜是不对称的磷脂双分子层，LPS和β-筒状Omp镶嵌在外膜上。研究发现细菌LPS和Omp不但具有维持外膜结构和保证物质运输的功能，还参与细菌的致病特别是宿主细胞的黏附入侵，诱导炎症反应和抵抗血清中补体系统杀菌作用等一系列的功能［14］。H.parasuis的LPS和Omp和毒力有一定的联系。Ruiz A等［15］比较了从发病猪的实质器官和健康动物的上呼吸道分离的不同H.parasuis Omp型，发现36.3ku～38.5ku的Omp可能与毒力相关。在全基因序列中，只有OmpP2和OmpP5的分子质量恰好符合与毒力因子范围，也被鉴定为潜在的毒力因子。H.parasuis LPS和其他的细菌一样作为内毒素在致病过程中发挥着重要的作用，同时也部分介导对宿主细胞的黏附作用和炎性因子的释放。

1.1 外膜蛋白P2

外膜蛋白P2基因（OmpP2）属于微孔蛋白，基本功能是形成亲水通道以利于环境中小分子物质进入胞内。目前流感嗜血杆菌OmpP2蛋白的生理功能和致病机理的研究较为透彻OmpP2是流感嗜血杆菌的一个毒力因子，是逃避宿主补体杀伤和参与宿主细胞的黏附作用的一个重要免疫原性蛋白［16］。在b型的流感嗜血杆菌中，缺失了OmpP2基因后导致菌株对小鼠致病力的下降［17］。最新研究表明流感嗜血杆菌OmpP2膜外结构域能激活宿主细胞的信号通路分子并诱导促炎症因子的表达，表明了OmpP2蛋白在病原菌致病性中起着重要作用［18］。

H.parasuis OmpP2是外膜中最丰富的蛋白，也是最受关注度的外膜蛋白。OmpP2蛋白表现出了很大程度的序列异质性，这种序列异质性可能与宿主的免疫压力相关，也可能与菌株的毒力有一定的联系。赵倩等［19］研究发现，H.parasuis中存在两个不同的蛋白结构，在大多数的毒力参考菌株和系统分离菌株中存在两个不连续的基因序列缺失，即参考菌株血清型为2、4、5、10、12、13、14和15的菌株中OmpP2基因存在两处连续碱基缺失，而参考菌株血清型为1、3、6、7、8、9和11的菌株中 OmpP2基因没有这种缺失情况，暗示了这种缺失现象主要在强毒力血清型的菌株中，分别将参考菌株血清5和11型的OmpP2基因构建在真核表达载体上，转染Marc-145细胞。结果发现血清5型OmpP2基因有明显的细胞毒性作用，且随着转染中质粒剂量的增加，对细胞的毒性作用也随之增加，表现出明显的量效关系；而血清11型的OmpP2基因在相同剂量和转染条件下对Marc-145细胞没有明显的细胞毒性作用。以上结果说明了H.parasuis OmpP2基因结构特征与毒力的关系，碱基连续缺失的OmpP2基因是H.parasuis的一个毒力相关基因。但是ompP2基因具体的功能还是不清楚的。

Zhang B等［4］通过自然转化的方法构建了H.parasuis血清4型的临床分离株SC096的ompP2的基因缺失菌株（ΔompP2）。和野生菌株SC096相比，ΔompP2缺失株表现出了显著地生长能力的下降，表现出了对猪和兔血清中补体杀菌敏感性的显著升高。OmpP2蛋白的缺失还表现出了对猪肺泡巨噬细胞的黏附能力和细胞外的生存能力下降。同时，从SC096菌株提取纯化的OmpP2蛋白也介导了对肺泡巨噬细胞的黏附作用［20］。以上结果表明OmpP2在维持细菌生长、抗血清中补体杀菌作用和对宿主细胞的黏附作用中发挥着重要的作用。抵抗血清中补体作用和黏附宿主细胞被认为是H.parasuis致病机制。因此，以上结果说明ompP22基因是H.parasuis的一个毒力因子。

1.2 外膜蛋白P5

H.parasuis OmpP5蛋白由ompP5基因编码，是OmpA蛋白家族的一员。外膜蛋白A家族是革兰阴性菌外膜中的主要成分并具有保守性，其主要作用是维持外膜的完整，此外在细菌的致病侵袭过程中发挥着重要作用［21］。在致病性大肠埃希菌中，OmpA具有抵抗补体介导的血清的杀伤的作用抗大肠埃希菌OmpA抗体与补体形成抗原抗体复合物，通过经典途径溶解杀伤细菌［22］。OmpA通常认为是细菌的黏附素并参与了入侵作用。在流感嗜血杆菌中，OmpP5蛋白是菌株定殖在栗鼠鼻咽和感染中耳的必需因子［23］。通过阻断与受体的相互作用能减少流感嗜血杆菌在上呼吸道的定殖能力和降低感染过程导致的严重疾病。在多杀性巴氏杆菌和猪放线杆菌中也证实了OmpP5参与了细菌的黏附作用［24］。另外，在大肠埃希菌中证实了OmpA是入侵脑静脉血管内皮细胞的重要的因子，缺失了OmpA基因的细菌比野生型在入侵细胞上下降了25倍～50倍［25］。

H.parasuis OmpP5也表现了相当大的异质性，包括四个高变区，主要编码四个预测的细胞表面暴露环。在H.parasuis SC096菌株中，当缺失了ompP5基因，细菌的生长能力受到了明显的影响。但野生菌株和缺失株的其他方面的表型，包括对猪和兔血清的杀菌作用、对PK-15细胞和PUVEC的黏附入侵能力都没有明显的变化［26］。

1.3 H.parasuis LPS的庚糖基转移酶

LPS包括了3个部分，即类脂A、核心多糖和O侧链。脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）是缺少 O侧链。然而，H.parasuis可能表达LPS，也可能表达LOS。革兰阴性菌LPS在致病性中发挥着重要的作用，例如在黏附、入侵、血清敏感性、抗生素抗性和内毒素等作用在致病机理方面。H.parasuis LPS和其他的细菌一样在致病中产生内毒素性休克、加剧临床症状和加速死亡等症状中挥着重要的作用。Bouchet B等［27］发现H.parasuis的LOS能够部分介导对新生猪气管上皮细胞（NPTr）的黏附作用，另外，LOS能够激发NPTr的IL-6和IL-8释放和诱导半胱天冬酶-3-介导的细胞凋亡。

根据序列比对和功能预测，Xu Z等［12］阐明了在SH0165菌株LPS生物合成通路中的相关基因，发现合成类脂A和内部核心寡糖的相关合成基因在嗜血杆菌属中是高度保守的，反映了核心结构在维持外膜完整性中发挥着重要的作用。内部核心结构通常包括3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo）和L-乙酰-D-甘露庚糖（L，D-Hep）。在结构上，内部寡糖链和脂寡糖链通过糖基转移酶连续的将糖基转移到类脂A（Lipid A）上面。类脂A部分的骨架的6’位是2→4位连接的二糖3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo），第一个庚糖通过庚糖基转移酶（heptosyltransferase）将其转移到第一个Kdo基团的5位上。缺失Kdo或Lipid A的缺失株是致死的，但是庚糖的缺失是能实现的，并能够使LPS的结构有明显的缩短，因此庚糖基因的缺失株是研究LPS功能的理想靶基因。通过对副猪嗜血杆菌SH0165的基因组信息进行查找，鉴定了opsX，rfaF和waaQ3个基因，这3个基因能够编码庚糖基转移酶，负责将3个庚糖（庚糖Ⅰ、庚糖Ⅱ和庚糖Ⅲ）转移到脂寡糖上。

在致病性的革兰阴性菌中，对opsX和rfaF基因的敲除使得细菌不能将第1个和第2个庚糖转移到Kdo上，导致了缺失株的糖链变短，同时也降低了对宿主的致病性。通过比对H.parasuis SH0165株的基因组序列，鉴定了编码能够将庚糖转移到LPS上的heptosyltransferase（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因opsX、rfaF和 waaQ。Xu C等［28］利用自然转化的方法在SC096株中构建了 ΔopsX、ΔrfaF和ΔwaaQ缺失菌株以及相应的互补株。结果发现只有opsX基因缺失株的生长速度稍有下降，互补菌株恢复到野生型水平。其他两个菌株的生长速度无明显的变化。在脂寡糖糖型的变化中，ΔopsX和ΔrfaF缺失株都有明显缩短的LPS结构，推测庚糖Ⅰ和庚糖Ⅱ缺失株的脂寡糖的缺失结构可能是Kdo-Lipid A和Hep-Kdo-Lipid A，而ΔwaaQ缺失株没有明显的变化，庚糖Ⅲ位于LPS的侧链上。ΔopsX、ΔrfaF和ΔwaaQ缺失株都降低了对猪和兔血清中补体的杀菌作用，说明了H.parasuis庚糖Ⅰ、庚糖Ⅱ和庚糖Ⅲ在抵抗宿主的先天性防御中发挥着重要的作用。在宿主细胞的相互作用中，ΔopsX、ΔrfaF缺失菌株对PK-15和PUVEC细胞的黏附和入侵能力有显著地下降，而ΔwaaQ缺失菌株没有明显的变化，该结果说明了H.parasuis可能与LPS的结构相关，LPS结构缩短的菌株的黏附入侵能力有显著地下降，说明了LPS糖链的长度可能影响了副猪嗜血杆菌的黏附入侵能力。因此，LPS中编码庚糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的opsX、rfaF和waaQ基因是H.parasuis的毒力因子。

2 H.parasuis潜在的毒力因子

2.1 在体外模拟体内感染条件下鉴定潜在的毒力因子

感染H.parasuis后猪通常出现体温升高的症状，这是致病性的重要特征之一。为了模拟体内环境，将H.parasuis培养在热压力的环境下，通过差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）和基因芯片的方法寻找差异表达的基因［5-7］。Hill C E等［5］利用DDRT-PCR的方法在热诱导下鉴定了7个差异表达的基因，分别编码转运、代谢、脂肪酸和氨基酸合成等相关蛋白。该研究是首次利用H.parasuis在体外模拟宿主环境鉴定潜在毒力因子。Melnikow D S等［7］也利用在体外模拟体内的H.parasuis感染环境，包括缺铁、酸和温度压力及在微需氧环境等条件下，利用基因芯片技术来鉴定差异表达基因。结果显示共鉴定了75个差异表达的基因，主要是编码铁和糖代谢产物的转运蛋白、代谢酶、核酸代谢和假定蛋白等。其中一些基因与巴斯德菌属其他菌株的已知毒力因子的核酸序列具有高度同源性。这两个研究虽然都对H.parasuis潜在毒力因子进行了分析，但并未进行进一步的功能验证，其作为毒力因子的生物学意义尚不清楚。

铁是几乎所有细菌必需的营养元素，捕获和摄取铁对于感染过程中细菌的生存和增殖都是必需的。由于在宿主体内铁的含量低，致病菌螯合铁的能力被认为是致病力密切相关。为了研究H.parasuis对缺铁环境的反应，研究者采用基因芯片技术［7］、DDRT-PCR［8］和 转 录 序 列 选 择 性 捕 获（SCOTS）［9］等多种技术来研究其与细菌毒力的关系。在铁限制的条件下，Metcalf D S等［8］通过DDRT-PCR发现了10个差异表达的基因，在猪脑脊液存在的情况下发现了9个差异表达的基因。在铁限制或在脑脊液存在的情况下有5个基因片段同时上调的现象，分别是腺苷酸基琥珀酸合成酶（purA）、2’，3’-环核苷酸磷酸二酯酶（cpdB）、脂蛋白信号肽（spA）、焦磷酸还原酶（lytB）和过氧化物歧化酶（sodC）。为了进一步研究差异基因和毒力的关系，在15个血清型的参考菌株中对上调基因片段的进行了筛选。值得注意的是，cpdB在15个血清型中存在两种不同的基因长度。分离自患病猪的参考菌株的片段为394bp，而从健康猪群的菌株的片段为1 463bp，这个结果暗示了394-bp的片段可能和大多数参考菌株的毒力有一定关系。但是394bp的cpdB基因片段和临床分离株在统计学上没有显著相关性。因此，在H.parasuis中不同的长度的cpdB功能还需要进一步的研究。Xie Q等［9］利用SCOTS方法研究铁限制压力下H.parasuis的转录反应。有36个基因上调，分为为6个不同功能群：细菌表面蛋白、核酸代谢、能量代谢、糖代谢、氨基酸代谢和转运结合蛋白。有趣的是在上调基因中，Clp蛋白酶编码蛋白属于Clp／HSP100分子伴侣家族，能够从聚合状态中拯救出变性的蛋白，在高温、酸性、氧化和铁限制生长的情况下用DNA芯片技术也鉴定出该应激蛋白编码基因。因此，Clp蛋白酶与毒力的联系值得进一步研究。另外，ArcB感应激酶的表达量上调也已经被鉴定在限铁的条件下。ArcB属于双组份转导系统（2-CS）的组氨酸激酶。2-CS在细菌适应环境变化和致病过程的调节中发挥着重要的作用，包括环境变化时发挥作用的组氨酸激酶（HK）和一种能够被相应HK激活的反应调节因子。根据KEGG数据库中已经报道的H.parasuis SH0165的基因组，可找到3对双组份系统分别是CpxAR、QseCB和ArcBA。另外，在巴斯德菌科的细菌中CpxAR、QseCB和ArcBA已被鉴定为毒力因子。因此，ArcB在致病过程中的作用还需进一步研究证实。

2.2 在基因组的水平上鉴定潜在的毒力因子

抑制性消减杂交技术也被用于鉴定Nagasaki和SW114（血清3型无毒力菌株）、SH0165（血清5型毒力菌株）和7140（血清4型无毒力菌株）的遗传差异［11，13］。通过该方法鉴定出15个差异表达基因片段存在于Nagasaki菌株中，而不存在于SW114菌株中，它们编码的蛋白分别属于细菌表面蛋白、核酸代谢、应激反应、噬菌体、菌毛相关蛋白和一些未知蛋白，对参考菌株的PCR检测显示，大部分的基因只存在于毒力和中等毒力血清型菌株，不存在于低毒力或无毒力血清型菌株［13］。Wang X 等［11］研究发现，有33个基因片段只存在于SH0165而不存在于7140菌株，分别sclB家族、限制性修饰系统、噬菌体产物、转运系统、外膜蛋白和核酸代谢。通过统计分析发现，sclB7、sclB11、ABC-型转运子、nhaC和fhuA基因在毒力菌株中比无毒力菌株中更普遍存在。属于sclB家族的sclB7和sclB11基因和毒力相关基因与三聚体自动转运子（VtaA）有很高的同源性。副猪嗜血杆菌含有17个拷贝的三聚体自动转运子（vtaA），它的结构域含有类似黏附素，血凝素和入侵素的基序和重复特征，在毒力菌株和非毒力菌株中有很大的差异。该试验进一步说明了VtaA在H.parasuis致病中发挥着重要的作用。

为了进一步鉴定毒力因子，Xu Z等［12］比较了H.parasuis SH0165株和其他巴氏杆菌科的细菌基因组，包括杜克雷嗜血杆菌35000HP、流感嗜血杆菌Rd、睡眠嗜血杆菌129PT、胸膜肺炎放线杆菌JL03、琥珀酸放线杆菌130Z、伴放线嗜血杆菌NJ8700、伴放线放线杆菌D11S-1、巴氏杆菌Pm70和曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E，结果显示H.parasuis许多毒力因子在基因组水平上被鉴定，例如多糖、菌毛和铁摄取系统。特别是发现了编码糖基转移酶／脂多糖的生物合成蛋白wbgY和与细菌荚膜多糖生物合成相关的蛋白的潜在毒力基因capD已经在Nagasaki基因组中被鉴定出来，而在SW114弱毒参考菌株中却没发现2个基因［13］。在革兰阴性菌中，荚膜位于外膜的外部，由高度亲水的阴离子多糖组成，能够通过抗吞噬，保护细菌免受补体的杀伤作用和介导对细胞表面的黏附作用等致病过程中发挥着重要的作用。在H.parasuis中，荚膜可能和抗吞噬相关，但H.parasuis荚膜致病相关的分子机制在很大程度上还是未知的。

3 总结

在养猪业中，H.parasuis被认为是能明显产生危害的细菌性病原因素之一，同时也被认为是猪呼吸系统疾病综合因素中重要的病原诱因。但是H.parasuis在临床上表型差异菌株广泛存在，尤其是对不同毒力表型菌株差异的本质认识不足，关于毒力相关因子和细菌感染宿主过程中如何发挥致病作用以及病原宿主相互作用的分子基础等知之甚少。近年来一些新技术和新方法的利用开始逐渐的揭示H.parasuis的毒力因子，为致病机制的研究提供了一定的基础。重要的是遗传操作方法的建立和基因缺失株的构建，对潜在毒力因子的功能鉴定和致病机制的研究提供了技术平台。

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