尿液蛋白质组学

赵国顺，赵兴绪，张 勇，武小虎，刘姗姗，陶金忠

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；3.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

由于尿液具有收集简单、非侵入性等特点，早在1927年，人们就利用从孕妇尿液中发现的β人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）发明了早孕测试纸，这是人类对尿液蛋白质的早期利用。随着蛋白质组学研究的发展，尿液蛋白质组学也得到了迅速的发展，这让尿液蛋白质的检测，尤其是尿液中生物标记物的检测成为尿液蛋白质组的研究热点。一般来说，生物标记物是指可以在活体中检测到的具有特征性的可以指示生理功能或结构改变的生物分子，蛋白质也是其中的一种。

1 正常尿液蛋白质组学研究的发展历程与现状

1996年，Marshall T等[1]首次运用双向电泳（two－dimensional electrophoresis，2DE）技术分离尿液中蛋白质，建立了正常人尿液蛋白质组2DE图谱并提出了“尿蛋白质组学”（urinary proteomics）的概念，即利用蛋白质组学技术高通量、系统性地分析和鉴定尿液中的所有蛋白质分子并研究其生物学功能。尽管这项试验没有做后续的研究，但开启了人们对尿液蛋白质组学的研究历程。1997年，Heine G等[2]鉴定出正常人尿液中的白蛋白、载脂蛋白、免疫球蛋白、胶原蛋白等34个高丰度蛋白质。2002年，Thongboonkerd V等[3]分离鉴定出正常人尿液中的67种蛋白质及其亚型。但由于尿液含有大量的高丰度蛋白，这在很大程度上影响了尿液蛋白质组的进一步研究。2004年，Pieper R等[4]采用免疫亲和扣除色谱技术（immunoaffinity subtraction chromatography）去除尿液中高丰度蛋白，用双向电泳分离出约1400个蛋白点，用质谱技术检测其中420个点，鉴定出150种蛋白质。2006年，Adachi J等[5]应用一维凝胶电泳与液相色谱配合线性离子阱－傅立叶变换离子回旋共振质谱（linear ion trap－Fourier transform mass spectrometer，LTQ－FT）技术和LTQ－Orbitrap电场轨道阱回旋共振组合质谱（linear ion trap－orbitrap mass spectrometer，LTQOrbitrap）技术从正常人的尿样中鉴定出1534种蛋白，其中大多数是膜蛋白。2009年，Alex K等[6]通过超速离心、凝胶电泳、离子交换、反相色谱等方法分级分离与提取尿液中的蛋白质，用LTQ－Orbitrap质谱与液相色谱－串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC－MS／MS）技术鉴定出2362种蛋白质，新发现1000多种，其中包括肾小球滤过细胞因子、脱落的细胞表面因子、肾脏与泌尿道产生的转运体与结构蛋白等，这些蛋白涉及到了25种常见病与500多种罕见病。近年来，Kim K H等[7]用改进的等电聚焦与非对称流场流（isoelec－tric focusing－asymmetrical flow field－flow fractionation，IEF－AF4）分离，用纳流液相色谱－电离－串联质谱（nanoflow liquid chromatography－electrospray ionization－tandem mass spectrometry，nLC－ESI－MSMS）技术纯化并鉴定出尿液中的245种蛋白质，其中新发现110种蛋白质。

尿液中含有由肾脏上皮细胞分泌的小泡－外核体（exosomes），其反映着疾病病理机制的细胞进程，其中含有蛋白质、mRNA、miRNA和信号分子，多数蛋白与疾病相关[8]。研究外核体蛋白质组不仅有助于认识外核体在肾脏中的功能，而且有助于寻找反映疾病发病机理的生物标志物[9]。2004年，Pisitkun T等[10]从尿液外核体内分离出295种蛋白质，其中包括多种遗传病的生物标记物。2009年，Gonzales PA等[11]从人尿液外核体内检测到1412种蛋白质，其中可确定的有1132种，新发现927种，有177种与OMIM数据库发布的数据相匹配。2011年，Hiemstra TF等[12]在去除尿调蛋白后，用质谱技术检测到外核体内的288种蛋白质。2012年，Wang Z等[13]用多维蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology，Mud－PIT）从9个人的尿液外核体中分离到3280种蛋白质，相互之间的重复率是31%，从每个人的尿液中可检测到1000多种蛋白。

2 与生理和病理相关的尿液蛋白质组学研究

肾小球主要依赖蛋白质分子量大小与带电量的多少选择流经肾脏的血液蛋白质被滤过还是被重吸收，其中将有30%的蛋白质被滤过[14]。无论生理状态改变还是病理变化都可以影响尿液内的蛋白质，通过检测这些蛋白含量与成分的改变，就可以了解机体的发育和生理代谢以及疾病的发生、发展及愈后。

2.1 尿液中的血液蛋白质

肾小球每天可以产生150L～180L的超滤液，而只有不到1%的超滤液形成尿液排出[15]，尿液中除超滤液外还有肾脏分泌物。尿液中有70%的蛋白质来源于肾脏，其余30%的蛋白质来源于血液[16]。通过血液与尿液蛋白质组的比较可以区分蛋白质的来源，确定某种蛋白质是来源于泌尿系统还是其他系统。

Jia L等[17]将肾脏比作黑盒，把血液中的2611种与尿液中的1522种高度可信的蛋白质基于蛋白质数据库分为3组数据库，即血液蛋白质组、尿液蛋白质组、血液－尿液蛋白质组，通过生物信息学比较，鉴定出肾脏滤过的蛋白质及肾脏分泌的和排出的蛋白质。这为认识尿液蛋白质组的构成特点提供了一种新思路。

Candiano G等[18]用双向电泳从尿液中检测到1118个高重复性点，用质谱技术鉴定出82种蛋白质及其亚型，其中30种也存在于血液中。

2.2 尿液中与生殖和发育相关的蛋白

Castagna A等[19]用双向电泳技术研究了与女性生理激素周期相关的尿液蛋白质。选取女性月经周期的中期（G1）、黄体期（G2）还有药物避孕2个月（G3）这三个阶段的尿液，通过4组试验（G1vs.G2、G1vs.G3、G2vs.G3和 G（G1＋G2）vs.G3）的比较发现了115个随月经周期而变化的蛋白质，并鉴定出一种新的雌激素（孕酮）药物。

Lee RS等[20]运用纳升－电喷雾－液相色谱－串联质谱（nano－ESI－LC－MS／MS）技术比较了不同发育阶段鼠的尿液蛋白质。将小鼠按照出生后的天数分为出生后1d（P1），出生后3d（P3），出生后7d（P7），出生后14d（P14）和出生后30d以上（P30），通过比较这5个阶段的尿液蛋白质，发现了15种与幼鼠的细胞黏连、结构、增生和分化有关的蛋白质，其中黏连蛋白、E－钙黏着蛋白和α1胶原蛋白出现在P1－P14期；Delta－like出现在 P1－P7；上皮生长因子出现在P7－P30；还发现有30种成年鼠分泌的蛋白质，其中有13种来源于前列腺和精囊腺，8种是由前列腺分泌，1种由精囊腺分泌，还有1种由mRNA编码的蛋白质在两种器官中都存在，其中由前列腺分泌的Probasin与雄性动物成熟有关。这表明在产后啮齿类动物的发育中，尿液蛋白质组差异较大。

Charlton J R等[21]运用抗体芯片和ELISA技术分别鉴定早产儿（33周～35周出生）和足月儿（38周～40周出生）从出生到12个月的尿液蛋白质，结果发现，在出生时，早产儿尿液中的胰岛素样生长因子结合蛋白－1、－2、－6，巨噬细胞趋化蛋白－1，CD14和Siglec－5的含量比足月儿高，但在2～6个月内会降到同一水平，而许多足月儿尿液中标记物在1年内保持稳定。因此，妊娠和产后的时间对尿液蛋白质也有影响。

2.3 尿液中与代谢相关的蛋白

Kohler M等[22]用双向电泳联用纳升超高效液相色谱－LTQ Orbitrap 质谱（nano－UPLC－LTQ Orbitrap MS）技术研究了锻炼对尿液中蛋白质的影响。结果发现锻炼者体内的血色素结合蛋白、牛血清白蛋白、血清类黏蛋白1、转铁蛋白和碳酸酐酶1表达上调。这为运动员在训练和比赛中建立生理监测系统，也可以作为兴奋剂的补充检测提供了科学依据。

Airoldi L等[23]运用双向电泳和质谱技术比较了健康的吸烟者和不吸烟者的尿液蛋白组，结果发现在吸烟者体内3种炎性蛋白（S100A8、间－α－胰蛋白酶抑制剂重链4、CD59）和两种胰－α淀粉酶表达上调，锌－α2糖蛋白表达下调，其中锌－α2糖蛋白和胰－α淀粉酶含量的变化可能会诱发疾病，因此可以作为由吸烟引起的疾病的生物标记物。

2.4 尿液中的疾病蛋白标记物

最新数据的人类尿蛋白质组数据库（human urinary database，http：／／mosaiques－diagnostics.de／diapatpcms／mosaiquescms／front＿content.php？idcat＝257）收录了13020个尿液样品。其中发现的人的生物标记物涉及的疾病主要有移植相关疾病（造血干细胞移植、肾移植、肾移植、肝移植等），泌尿道疾病（膀胱输尿管逆流、输尿管连接部梗阻、肾脏疾病、膜性肾小球肾炎、肾结石、IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化、糖尿病肾病、多囊性肾病、急性肾脏损伤、范可尼综合征、微小病变性肾病等），生殖道疾病（良性前列腺增生症、先兆子痫、多囊卵巢综合征等），脑血管疾病（脉管炎、血栓形成、高血压、心脏衰竭、1型与2型糖尿病、冠状动脉疾病等），肿瘤（嗜铬细胞瘤、卡波西氏肉瘤、膀胱癌、肾癌、前列腺上皮内瘤变、前列腺癌、法布里病、动脉瘤、结肠癌、肺癌、卵巢癌等），免疫性疾病（系统性红斑狼疮、人类免疫缺陷病毒、过敏性紫癜等），神经系统疾病以及其他一些疾病（肺炎、丙型肝炎、胆道闭锁、老年痴呆症、目盲、重症监护病房患者）等。而在这些疾病中，每一种疾病相关的蛋白标记物少则几种，多则一千多种，而这些标记物并不特异性的代表某一种疾病，如Tetaz R等[24]从肾移植慢性移植肾功能障碍的18个生物标记物中筛选出了一种诊断肾移植慢性移植肾功能障碍的蛋白，它的敏感性和特异性也只有93%和65%。

3 尿液蛋白组学数据共享

目前，国内外关于病理情况下尿液中蛋白质的数据已经非常丰富，但由于个体间以及个体内存在差异；早期小样本试验须经过大样本的验证才能确定；再者由于试验条件所限，单个研究机构研究的样本数和疾病种类都比较有限，很难解决生理和疾病相关标志物的可信度和特异性的问题，因此需要建立数据共享平台。如上面提及的人类尿蛋白质组数据库，还有尿液蛋白质生物标记物数据库（Urinary Protein Biomarker Database，http：／／122.70.220.102／biomarker／），它是基于PubMed数据库公布的可以用于标记疾病的蛋白质建立的，其中涉及到人类的10种癌症，31种泌尿外科疾病和15种非泌尿道疾病；涉及动物的21种泌尿道疾病和4种非泌尿道疾病。再有尿液外核体蛋白质数据库（Urinary Exosome Protein Database，http：／／dir.nhlbi.nih.gov／papers／lkem／exosome／），它是基于肾脏与电解质代谢实验室（Laboratory of Kidney and Electrolyte Metabolism，NHLBI）用两种质谱方法鉴定的外核体蛋白质而建立的，其中包括了1600中蛋白质。这些数据库的建立不仅可以解决数据的可靠性的问题，通过数据的比较还可以确定某种疾病的特异性蛋白。

4 挑战与展望

随着许多的蛋白质组学技术在尿液蛋白质组研究中的应用，在尿液中检测到的蛋白质也越来越多，尿液蛋白质的数据库也越来越丰富。目前，尿液蛋白质数据库中包含的蛋白质已经达到几千种，尿液中的大多数蛋白质已经被发现。正常尿液中的蛋白质也与大多数疾病有关，生理状态的改变和病理状态的变化都会影响尿液蛋白质。通过正常尿液与生理或病理状态的比较，筛选可以标记某种生理状态或某种疾病的蛋白。因此，一个正常状态下的尿液蛋白质数据库是非常必要的。虽然不能建立每一个个体实时的、动态性的尿液蛋白质组数据库，但是首先建立一个基本的共同尿液蛋白质组数据库是可行的，这些蛋白质虽然不可能与所有的疾病或生理状态的改变相关联，但可以显示大多数疾病或生理状态的变化。

大量的疾病标记物表明检测疾病状态的生物标记物已进入临床应用阶段，虽然生物标记物在“证据原则”下的研究是可行的，但是在大样本的研究中可以被确定的的生物标记物却很少。目前，检测标记生理状态变化的蛋白标记物的研究较少，但是迟早都会面临临床应用这一难关。Truong M等[25]基于Pubmed和Web of Science数据库，统计了在尿液中检测到的前列腺癌在基因组学、实验胚胎学、转录物组学、蛋白质组学和代谢组学中的生物标记物，结果表明每个单一学科都没有一种能够特异标记前列腺癌的生物标记物。动物机体作为一个完整的有机体，不仅仅包括蛋白质一种物质，而且试验已经证明一个生物分子不能完全标记一种疾病，一组镶嵌式的标记物将会更好的适用于疾病[26]，这估计也需要更多生物学科的整合，如“－omics”。

正如Amos Bairoch所说“近10年来，许多蛋白质组学产生的数据都是垃圾”[27]。由于不同实验室与平台之间、不同个体之间、同一个体的不同时间段、不同性别与不同年龄之间[28]甚至不同地域之间的尿液蛋白质都可能存在着差异；另外，年龄、性别、保存时间、反复冻融、保存温度[29]和是否添加蛋白酶抑制剂[30]也对尿液蛋白质的研究结果有影响，这些都是尿液蛋白质组研究发展需要克服难题，需要建立数据共享平台，协调各种研究工作，减少大量的重复工作，确保研究的可靠性，尽可能的将真实的数据应用于临床实际，这将是一项很艰巨的工作。目前，人类肾脏与尿液蛋白质组计划（http：／／www.hkupp.org／）、欧洲肾脏与尿液蛋白质（http：／／www.eurokup.org／）还有上面提及的几个组织等已经致力于这方面的工作。

[1]Marshall T，Williams K.Two－dimensional electrophoresis of human urinary proteins following concentration electrophoresis of human urinary proteins following concentration by dye precipitation[J].Electrophoresis，1996，17（7）：1265－1272.

[2]Heine G，Raida M，Forssman W G.Mapping of peptides and protein fragments in human urine using liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，1997，776（1）：117－124.

[3]Thongboonkerd V，McLeish K R，Arthur J M，et al.Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation[J].Kidney Int，2002，62（4）：1461－1469.

[4]Pieper R，Gatlin C L，McGrath A M，et al.Characterization of the human urinary proteome：a method for high－resolution display of urinary proteins on two－dimensional electrophoresis gels with a yield of nearly 1400distinct protein spots[J].Proteomics，2004，4（4）：1159－1174.

[5]Adachi J，Kumar C，Zhang Y，et al.The human urinary proteome contains more than 1500proteins，including a large proportion of membrane proteins[J].Genome Biol，2006，7（9）：R80.

[6]Alex K，Flavio M，Kevin D，et al.Urine proteomics for profiling of human disease using high accuracy mass spectrometry[J].Proteomics Clin Appl，2009，3（9）：1052－1061.

[7]Kim K H，Moon M H.High speed two－dimensional protein separation without gel by isoelectric focusing－asymmetrical flow field flow fractionation：application to urinary proteome[J].J Proteome Res，2009，8（9）：4272－4278.

[8]Van B W，Pisitkun T，Verhaar M C，et al.Exosomes and the kidney：prospects for diagnosis and therapy of renal diseases[J].Kidney Int，2011，80（11）：1138－1145.

[9]Moon P G，You S，Lee J E，et al.Urinary exosomes and proteomics[J].Mass Spectrom Rev，2011，30（6）：1185－1202.

[10]Pisitkun T，Shen R F，Knepper M A.Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（36）：13368－13373.

[11]Gonzales P A，Pisitkun T，Hoffert J D，et al.Large－scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes[J].J Am Soc Nephrol，2009，20（2）：363－379.

[12]Hiemstra T F，Charles P D，Hester S S，et al.Uromodulin exclusion list improves urinary exosomal protein identification[J].J Biomol Tech，2011，22（4）：136－145.

[13]Wang Z，Hill S，Luther J M，et al.Proteomic analysis of urine exosomes by multidimensional protein identification technology（MudPIT）[J].Proteomics，2012，12（2）：329－338.

[14]Calvano C D，Aresta A，Iacovone M，et al.Optimization of analytical and pre－analytical conditions for MALDI－TOFMS human urine protein profiles[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51（4）：907－914.

[15]Berger R P，Kochanek P M.Urinary S100Bconcentrations are increased after brain injury in children：apreliminary study[J].Pediatr Crit Care Med，2006，7（6）：557－561.

[16]Thongboonkerd V，Malasit P.Renal and urinary proteomics：current applications and challenges[J].Proteomics，2005，5（4）：1033－1042.

[17]Jia L，Zhang L，Shao C，et al.An attempt to understand kidney＇s protein handling function by comparing plasma and urine proteomes[J].PLoS One，2009，4（4）：e5146.

[18]Candiano G，Santucci L，Petretto A，et al.2D－electrophoresis and the urine proteome map：where do we stand？[J]J Proteomics，2010，73（5）：829－844.

[19]Castagna A，Olivieri O，Milli A，et al.Female urinary proteomics：New insight into exogenous and physiological hormone－dependent changes[J].Proteomics Clin Appl，2011，5（5－6）：343－53.

[20]Lee R S，Monigatti F，Lutchman M，et al.Temporal variations of the postnatal rat urinary proteome as a reflection of systemic maturation[J].Proteomics，2008，8（5）：1097－1112.

[21]Charlton J R，Norwood V F，Kiley S S，et al.Evolution of the urinary proteome during human renal development and maturation：variations with gestational and postnatal age[J].Pediatr Res，2012，72（2）：179－185.

[22]Kohler M，Walpurgis K，Thomas A，et al.Effects of endurance exercise on the urinary proteome analyzed by 2－D PAGE and Orbitrap MS[J].Proteomics Clin Appl，2010，4（5）：568－576.

[23]Airoldi L，Magagnotti C，Iannuzzi A R，et al.Effects of cigarette smoking on the human urinary proteome[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，381（3）：397－402.

[24]Calvano C D，Aresta A，Iacovone M，et al.Optimization of analytical and pre－analytical conditions for MALDI－TOF－MS human urine protein profiles[J].J Pharm Biomed Anal，2010 ，51（4）：907－914.

[25]Truong M，Yang B，Jarrard D，et al.Towards the detection of prostate cancer in urine：a critical analysis[J].J Urol，2012，189（2）：422－429.

[26]Service R F.Proteomics.Proteomics ponders prime time[J].Science，2008，321（5897）：1758－1761.

[27]Weeks M E.Urinary proteome profiling using 2D－DIGE and LC－MS／MS[J].Methods Mol Biol，2010，658：293－309.

[28]Afkarian M，Bhasin M，Dillon S T，et al.Optimizing aproteomics platform for urine biomarker discovery[J].Mol Cell Proteomics，2010，9（10）：2195－2204.

[29]Havanapan P O，Thongboonkerd V.Are protease inhibitorsrequired for gel－based proteomics of kidney and urine[J].J Proteome Res，2009，8（6）：3109－3117.

[30]Albalat A，Mischak H，Mullen W.Urine proteomics in clinical applications：technologies，principal considerations and clinical implementation[J].Prilozi，2011，32（1）：13－44.