胎羊肾细胞用于增殖H1N1亚型流感病毒的初步研究

向 敏，高其双，陈志华，黄海军，卢 顺，彭 霞，陶弼菲，占才耀，夏 瑜，华 娟，童伟文，王莲芳

（武汉市畜牧兽医科学研究所，湖北 武汉 430208）

近年来，流行的甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感，传播速度快，波及范围广，给人们的健康和养殖业带来了新的威胁。直到目前，人类还没有研制出用于治疗流感的特效药物，预防和控制流感主要依靠接种流感疫苗。在我国，流感疫苗的生产还主要依靠传统的鸡胚培养技术[1]。这种技术需要耗用大量的优质鸡胚，生产成本高，质量难以控制。此外，利用鸡胚生产流感疫苗，在处理废弃的鸡胚残体时只能采用焚烧或其他无害化的处理方法，对环境有一定的污染。相比之下，细胞培养流感病毒具有周期短、质量易控制、抗原性好和环保等优点，所以WHO建议使用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗[2]。国内外的研究者也将细胞培养流感病毒作为流感疫苗研究的方向，探索用细胞培养流感病毒的生产工艺。目前用于培养流感病毒的细胞主要有MDCK细胞和猴肾细胞（Vero），关于流感病毒疫苗的研究也主要依靠这两种细胞[3]。因此，寻找新的适合于流感病毒增殖的细胞，能为流感病毒及其疫苗的研究工作提供更多的选择。

本研究取胎羊肾组织制备原代细胞，研究胎羊肾细胞用于流感病毒增殖的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及毒株 MDCK细胞由华中农业大学动物医学院惠赠；H1N1亚型流感病毒A／WS／33株购自武汉大学典型培养物保藏中心，由本研究室保存。

1.1.2 鸡胚与实验动物 SPF鸡胚购自梅里亚维通公司；怀孕60d的健康麻城黑山羊。

1.1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基（粉剂）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶购自GIBCO公司；新生牛血清购自武汉双博亚农业生物科技有限公司；双抗和TPCK胰酶购自Sigma公司；地高辛糖苷键分析试剂盒（DIG glycan differentiation kit）购自Roche公司；荧光素标记的鼠抗地高辛抗体购自Jackson公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液和消化液的配制 细胞培养液及消化液参考文献[4]所述的方法进行配制。细胞培养液：DMEM高糖培养基按说明书配制成溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，加入150mL／L胎牛血清（或新生牛血清）和青霉素、链霉素各100单位／L，4℃保存备用。消化液：取胰蛋白酶粉剂，用0.01mol／L的无Ca、Mg的PBS配制成2.5g／L胰蛋白酶－0.2mL／L EDTA 的细胞消化液，0.22μm滤膜过滤除菌，分装10mL小瓶，置－20℃冻存备用。

1.2.2 细胞分离与原代培养 将怀孕60d的母羊麻醉，在无菌环境中作剖腹手术取出胎儿，立即放入盛有约100mL灭菌无Ca、Mg的PBS的烧杯中，密封杯口，快速移入无菌室，在超净工作台内取出胎儿肾组织。参考文献[5]所述的方法，用眼科剪将肾皮质区域剪成糜状，吸取无Ca、Mg的PBS液反复冲洗，加入消化液于37℃消化30min，离心收集细胞制备成单个细胞悬液，用培养液调整细胞密度至2×104个／mL，分装于100mL规格的一次性细胞瓶中，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中进行原代培养。

1.2.3 肾上皮细胞的初步纯化和传代 原代细胞长满细胞瓶底之后，吸弃培养上清，用细胞消化液消化细胞。将消化好的细胞用培养液重悬，参考文献[6]对原代细胞进行初步纯化。具体方法：重悬的细胞于37℃静置30min，稍加振荡，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起吸到另一细胞瓶中静置培养。细胞长满瓶底后，按此方法进一步纯化。3次纯化后，细胞按1∶2的比例（1瓶内的细胞接种到2个细胞瓶内）进行传代培养。

1.2.4 流感病毒受体的检测 取生长状态良好的胎羊肾细胞，弃去培养液，用地高辛糖苷键分析试剂盒中地高辛标记的凝集素DIG－SNA和DIG－MAA作为一抗，于室温下与待检的细胞孵育1h。PBS洗涤3次以后，加入荧光素标记的鼠抗地高辛抗体，室温下避光孵育1h。再次用PBS洗涤3次，置荧光显微镜下观察。同法检测MDCK细胞流感病毒受体，并设置一抗空白对照。

1.2.5 流感病毒增殖试验

1.2.5.1 流感病毒的准备 H1N1亚型流感病毒经SPF鸡胚传代扩增后，无菌收获尿囊液，置－80℃冻存备用。接种前，用含2μg／mL TPCK胰酶的维持液（含20g／L FBS的DMEM高糖培养基）稀释病毒。

1.2.5.2 病毒增殖及血凝价测定 选取培养48h生长良好的胎羊肾细胞若干瓶，弃去培养液，向每个瓶中加入稀释的病毒液1mL，摇晃使病毒液沾满细胞培养面，移入37℃培养箱静置1h，让病毒充分吸附细胞。吸附后向培养瓶中补加维持液5mL，放入培养箱中继续培养。每12h在显微镜下观察细胞一次，当细胞出现80%以上细胞病变时，立即将培养瓶移入－20℃冰箱中冻融2次，收获冻融物，直接血凝法测定病毒的血凝价[7]。同法用于 MDCK细胞检测，重复试验5次。

1.2.5.3 病毒在不同代次细胞中增殖的情况 将细胞进行传代培养，连传10代。每代细胞长满单层后，用流感病毒进行感染，待细胞出现80%以上病变时收获细胞培养物并冻融2次，直接血凝法测定每代细胞培养物的血凝价。

2 结果

2.1 细胞生长情况

原代的胎羊肾细胞静置培养至3d时，可看到部分细胞已贴壁生长，从形态上看主要是圆粒状细胞，也有一些长梭形的纤维细胞。培养至5d时，大部分贴壁的细胞均能分裂繁殖并形成细胞克隆，圆粒状细胞和梭形细胞克隆之间的界限较为明显（图1A）。经初步纯化后，大部分纤维细胞被去除，剩下的细胞经3次传代培养后，具有典型的上皮细胞特征。细胞的形态呈多角形，形态均一，折光性好，细胞之间排列紧密，形成鹅卵石样的单层聚集（图1B）。经数代体外培养，细胞的生长速度加快，由最初的5d传代一次变为3d传代一次。

图1 原代的胎羊肾细胞和传代的胎羊肾细胞（10×10）Fig.1 Primary goat embryonic kidney cells and subculture goat embryonic kidney cells（10×10）

2.2 细胞表面受体的检测

间接免疫荧光试验结果显示，胎羊肾细胞在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光，表明细胞表面有较为丰富的α2，6－Gal和α2，3－Gal受体（图2）。其中α2，6－Gal受体的荧光信号较MDCK细胞组更强烈，提示胎羊肾细胞的α2，6－Gal受体的含量比MDCK细胞更为丰富。未加一抗的细胞对照均无明显的荧光信号。

2.3 病毒增殖情况

胎羊肾细胞在感染流感病毒24h后，开始出现明显的细胞病变，细胞逐渐变圆，脱落。同样处理的MDCK细胞在接毒后40h才出现病变。通过比较5次血凝试验所测得的血凝价发现，胎羊肾细胞培养物的血凝价比MDCK细胞对照的血凝价稍高，具体见表1。

图2 胎羊肾细胞表面流感病毒受体的检测（40×10）Fig.2 Detection of influenza virus receptors on the surface of goat embryonic kidney cells（40×10）

表1 流感病毒血凝价的测定Table1 Determination of hemagglutination titers of influenza virus

通过测定不同代次胎羊肾细胞病毒培养物的血凝价发现，细胞传代没有对病毒的增殖造成明显的影响，10代细胞培养物的血凝价稳定在29以上（图3）。

图3 流感病毒在不同代次胎羊肾细胞培养物中的血凝价Fig.3 Hemagglutination titers influenza virus in different generations of goat embryonic kidney cell culture

3 讨论

根据细胞对不同病毒易感性的差异，人们可选择合适的细胞用于不同病毒的培养和疫苗生产。在体外培养中，较容易获得成功的是幼年动物的肾组织上皮细胞。比如猪肾细胞 （PK－15）、乳仓鼠肾细胞（BHK－21）、MDCK细胞和 Vero细胞等，均源于动物的肾脏组织。本研究选取胎羊的肾上皮细胞作为研究对象，研究其用于流感病毒增殖的可能性。初步的研究结果表明，该细胞可进行体外传代培养，且能用于流感病毒的增殖，具有很好的应用前景。

本研究结果表明，贴壁培养的胎羊肾细胞含有上皮细胞和成纤维细胞。利用成纤维细胞贴壁较快的特点，对原代细胞进行了初步的分离纯化，最终得到了较典型的上皮样细胞。原代的肾上皮细胞近似圆粒状，贴壁较浅。传代培养后，细胞的形态发生改变，逐渐变为多角形，生长速度有所加快。这说明胎羊肾细胞能适应体外培养环境，且具有稳定增殖的能力。

一种细胞是否对某种病毒易感，与该细胞表面的受体差异有很大的关系[8]。研究胎羊肾细胞表面的流感病毒受体，可直接证明该细胞用于增殖流感病毒的潜能。流感病毒的受体主要有α2，3－Gal和α2，6－Gal两种[9]，受体表达的丰度将直接影响到病毒的复制效率。间接免疫荧光结果显示，胎羊肾细胞表面的流感病毒受体，特别是α2，6－Gal受体，含量明显高于流感病毒研究中最常用的MDCK细胞，这可能是用本细胞培养的流感病毒血凝价高于MDCK细胞的原因之一。病毒增殖试验进一步证实该细胞能用于培养流感病毒，且细胞的传代培养对病毒的增殖没有造成明显的影响。当然，本研究仅用了H1N1亚型流感病毒，是否所有A型流感病毒都能在该细胞内大量增殖还有待研究。

目前用于增殖流感病毒的细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞，但这两种细胞表面的病毒受体表达丰度并不高[10]，导致细胞对病毒的敏感性偏低。本研究所获得的胎羊肾细胞兼具敏感性高和产毒量大的特点，如果能将该细胞驯化成传代细胞，则有望开发成一种新的流感疫苗生产用细胞系。此外，该细胞感染流感病毒后，病变较快，可及时得知接毒是否成功，这对病毒分离和培养非常有利。

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