猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1003株全基因序列测定与分析

施开创，林昌华，张步娴，官家明，李 军，钟 诚＊

（1.广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可以引起以母猪繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪呼吸道疾病为特征的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）。该病于1987年最早在美国发现[1]，现呈世界性分布，给养猪业造成严重危害。目前，PRRSV可以分为两种基因型，即以VR－2332株[2]为代表的美洲型毒株和以LV株[3]为代表的欧洲型毒株，两者基因组间核苷酸序列的同源性仅为60%左右[4]。1996年我国首次分离到PRRSV美洲型经典毒株[5]；2006年分离到以NSP2编码区存在第481aa和第533～561aa发生30个氨基酸的不连续缺失为标志的PRRSV美洲型高致病性变异毒株（HPPRRSV）[6]；2010年报道了 PRRSV 欧洲型毒株的存在和流行[7]。说明目前我国PRRSV流行毒株极为复杂。近年来，国内已有对HP－PRRSV流行毒株基因组进行测序与分析的报道，但迄今未见对PRRSV广西地方分离株基因组分子特征进行详细分析的报道。本研究对PRRSV广西分离株GX1003株的基因组序列进行测定和分析，为了解HP－PRRSV的遗传变异情况提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 PRRSV广西分离株GX1003株分离自2010年采集的广西发病死亡病猪的脾、肺、淋巴结等组织，经接种Marc－145细胞产生典型细胞病变（CPE），用RT－PCR及间接免疫荧光抗体试验（IFA）鉴定，证实为PRRSV毒株后置－70℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、pMD18－T载体、5′Full RACE Kit及3′Full RACE Kit，宝生物工程（大连）有限公司产品；质粒DNA小量提取试剂盒、DH5α感受态细胞，北京天根生化科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照PRRSV JXA1株基因组序列（GenBank登录号EF112445），设计并合成14对扩增区域相互重叠的特异性引物，用于扩增GX1003株全基因组片段；基因组的5′端和3′端分别采用5′Full RACE Kit和3′Full RACE Kit进行扩增（表1）。

表1 用于扩增PRRSV基因组序列的引物Table1 Primers used to amplify PRRSV genome

1.2.2 PRRSV GX1003株基因组的分段扩增及测序取GX1003株第3代细胞毒上清，按照试剂盒说明书提取总RNA，利用RNA PCR Kit反转录获得cDNA。以此为模板，建立50μL PCR反应体系：5×PCR buffer（含dNTP Mixture、Mg2＋）10μL，Ex Taq聚合酶（5U／μL）0.25μL，cDNA 5μL，上下游引物（25pmol／μL）各0.5μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，56℃～59℃30s，72℃120s，35个循环；72℃10min。反应结束后利用胶回收试剂盒回收PCR产物，连接到pMD18－T载体，转化DH5α细胞，阳性克隆经PCR、酶切鉴定后，送宝生物工程（大连）有限公司测序。每个扩增片段均送3个克隆进行重复测序。

1.2.3 PRRSV GX1003株基因组序列分析 利用Lasergene 7.1对各片段序列进行拼接，获得GX1003株全基因核苷酸序列。应用DNA Star软件包对国内外PRRSV美洲型及欧洲型参考毒株基因组进行核苷酸及其推导氨基酸序列的比对分析，并利用MEGA 5.0软件包的Neighbor－joining方法绘制系统进化树。

2 结果

2.1 PRRSV GX1003株基因组的分段扩增和测序

利用14对特异性引物、5′Full RACE Kit及3′Full RACE Kit，对GX1003株基因组进行分段扩增，得到16个与预期目的片段大小一致的扩增片段。经回收、连接、转化、克隆、测序、拼接后，获得GX1003株全基因序列长度为15320nt[不包括Poly（A）]。基因组首先是5′UTR；其后为9个开放阅读框（ORF）ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7，其中ORF1a编码非结构蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2～8，ORF1b编码非结构蛋白NSP9～12，ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7分别编码结构蛋白GP2a、GP2b（E）、GP3、GP4、GP5、M 和N；最后是3′UTR和Poly（A）尾。GX1003株基因组的组成见表2。已将GX1003株全基因序列发表在GenBank上，登录号为JX912249。

表2 GX1003株基因组组成及编码蛋白Table2 The composition of genome and the encoded proteins of GX1003strain

2.2 PRRSV毒株间基因组序列同源性分析

GX1003株与国内外PRRSV美洲型和欧洲型代表毒株的同源性见表3。GX1003株与比较的美洲型毒株基因组核苷酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%及82.1%～99.1%，与欧洲型代表株LV株的同源性分别为60.6%及51.3%。

GX1003株与比较的美洲型毒株5′UTR核苷酸序列的同源性为92.1%～100.0%，与LV株的同源性为62.8%；与比较的美洲型毒株3′UTR核苷酸序列的同源性为88.0%～98.7%，与LV株的同源性为70.8%。与比较的美洲型毒株ORF1a～ORF1b核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为82.0%～99.6%和80.3%～99.7%，与LV株的同源性分别为56.6%～63.3%及48.4%～68.9%；与比较的美洲型毒株NSP1～NSP12核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为75.5%～100.0%和70.7%～100.0%，与LV株的同源性分别为50.5%～68.8%及49.5%～75.0%；与比较的美洲型毒株ORF2～ORF7核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.8%～100.0%和86.1%～100.0%，与LV株的同源性分别为64.1%～69.7%和56.7%～80.5%。对各区域的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分析发现，ORF1a同源性最低，ORF6／M同源性最高（表3）。

2.3 PRRSV GX1003株与JXA1株、VR－2332株和RespPRRS MLV株的比对分析

将GX1003株基因组核苷酸及其推导氨基酸序列与HP－PRRSV代表株JXA1株进行比对分析，其主要变异结果见表4。与JXA1株相比，GX1003株在非编码区5′UTR没有发生变异，只在3′UTR发生2个nt的突变；在非结构蛋白编码区ORF1a、ORF1b中，GX1003株发生了74个nt、24个aa的突变，其中ORF1a有55个nt、19个aa发生突变，仅NSP2编码区就有21个nt、11个aa发生了突变；ORF1b有19个nt、5个aa发生突变，仅NSP9编码区就有11个nt、3个aa发生了突变；而与VR－2332株相比，GX1003株在NSP2蛋白第481位aa和第533～561位aa出现30个aa的不连续缺失，具有HP－PRRSV的遗传特征。与JXA1株相比，GX1003株在结构蛋白编码区ORF2～ORF7中，有27个nt、18个aa发生了突变，仅ORF4编码区就有10个nt、6个aa发生了突变。整个基因组没有核苷酸缺失和插入的现象。可见，NSP2、NSP9及ORF4为GX1003株基因组突变的高发区。

表3 GX1003株核苷酸及氨基酸序列与代表株的同源性分析Table3 The nucleotide and amino acid identity of GX1003compared with those of other PRRSV isolates

表4 GX1003株与JXA1株各基因编码区比对分析Table4 Genomic region comparison of GX1003 strain with JXA1strain

将GX1003株与美洲型疫苗株RespPRRS MLV（GenBank登录号 AF159149）、美洲型经典株 VR－2332株以及变异株JXA1株氨基酸序列进行比较，重要氨基酸位点的变异情况见表5。Allende R等[8]研究发现，PRRSV全基因序列中，有9个氨基酸的变异与PRRSV的毒力相关，其中4个位于非结构蛋白、5个位于结构蛋白。4个位于非结构蛋白的毒力相关位点中，它们在VR－2332株的位置分别为S331（NSP1β）、S668（NSP2）、E952（NSP2）（JXA1株相应位点为 E922）、Y952（NSP10），而疫苗株 RespPRRS MLV在这4个位点上发生突变，分别为S331→F331、S668→F668、E952→K952和Y952→H952（表5）。本研究的GX1003株非结构蛋白在这4个位点都没有发生变异。5个位于结构蛋白的毒力相关位点中，它们在VR－2332株的位置分别为L10（GP2）、G83（GP3）、R13（GP5）、R151（GP5）、Q16（M），而疫苗株RespPRRS MLV在这5个位点均发生了变异，分别由L10→F10、G83→E83、R13→Q13、R151→G151、Q16→E16。本研究的GX1003株结构蛋白在L10、R13、R151、Q16位点均未发生变异，而G83→S83（与JXA1株一致）（见表5）。以上结果表明，GX1003株具有强毒株的序列特征。

2.4 PRRSV不同毒株遗传进化分析

基于病毒全基因组核苷酸序列绘制遗传进化树（图1），可以将GX1003株及对比的国内外美洲型PRRSV参考毒株分为4个亚群，即以VR－2332株为代表的亚群1、以CH－1a株为代表的亚群2、以HB－1株为代表的亚群3、以JXA1株为代表的亚群4。GX1003株属于以JXA1株为代表的亚群4。

表5 GX1003株与RespPRRS MLV株、VR－2332株和JXA1株的氨基酸位点变异分析Table5 Amino acid changes among GX1003，RespPRRS MLV，VR－2332and JXA1strain

图1 基于病毒全基因组核苷酸序列的遗传进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of complete genome of viruses

3 讨论

全基因序列分析发现，GX1003株与PRRSV美洲型代表毒株全基因核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%和82.1%～99.1%，与欧洲型代表毒株LV株的同源性分别为60.6%和51.3%，同时GX1003株在NSP2编码区存在第481位aa和第533～561位aa 30个氨基酸的不连续缺失，表明GX1003株属于 HP－PRRSV。并且，GX1003株在9个潜在的毒力相关氨基酸位点中保持S331（NSP1β）、S668（NSP2）、E922（NSP2）、Y952（NSP10）、L10（GP2）、R13（GP5）、R151（GP5）、Q16（M）不变（除GP3的G83发生与JXA1株一致的G83→S83），具有致病性毒株的序列特征。因此可以推测，GX1003株属于美洲型 HP－PRRSV，具有高致病性。但也有学者认为，PRRSV分离株NSP2出现30个aa的不连续缺失与分离株的致病性无关，只能作为 HP－PRRSV的遗传标志[9]，分离株的实际致病性如何有赖于动物回归试验。GX1003株对仔猪的致病性试验正在进行之中。

美洲型毒株与欧洲型毒株之间基因组差异很大，其核苷酸序列的同源性仅为60%左右[4]，并且美洲型毒株之间、欧洲型毒株之间基因组亦存在较大的遗传变异[10－11]，这种变异还在持续加大之中[12]。就国内而言，不论是美洲型传统毒株、高致病性变异毒株，还是欧洲型毒株均有爆发和流行的报道[5－7]，临床上流行毒株日益复杂，但当前国内仍以NSP2蛋白发生第481aa和第533～561aa 30个aa不连续缺失为遗传标志的美洲型HP－PRRSV为优势流行毒株[13]。值得注意的是，与 HP－PRRSV代表株JXA1株相比，近年来各地分离到的 HPPRRSV毒株还在不断发生新的变异，出现大量具有不同变异特点的流行毒株[14－16]。本研究中，与JXA1株相比，GX1003株全基因共发生103个nt、42个aa的突变，分布在不同的编码区，以NSP2、NSP9及ORF4为基因组突变的高发区，其中NSP2编码区发生21个nt、11个aa的突变，NSP9编码区发生11个nt、3个aa的突变，ORF4编码区发生10个nt、6个aa的突变；整个基因组没有发生核苷酸缺失和插入的现象。这些结果表明，GX1003株虽然属于HP－PRRSV，但基因组发生了新的遗传变异，有其自身特点。

基于PRRSV全基因序列的遗传进化树，可以将所有美洲型参考毒株分为4个亚群，GX1003株在遗传进化树上属于亚群4。近年来，以高致病性变异毒株JXA1株为代表的亚群4已成为我国的流行优势毒株[13]，是当前国内防控的重点对象。但各地的流行病学调查表明，由传统毒株导致的PRRS疫情还占有一定的比例[17－18]，在防控实践中不容忽视。因此，加强临床监测及分子流行病学研究，及时掌握日益复杂的流行毒株及其遗传变异特点，对选择有效的疫苗以及采取其他有针对性的防控措施具有重要意义。本研究对PRRSV GX1003株全基因组进行测序和分析，丰富了国内PRRSV分子流行病学的基础数据。

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