传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

杜冬华，周 静，王爱华，王 磊，孙继国

（1.河北北方学院动物科技学院动物医学系，河北张家口075131；2.农标普瑞纳饲料有限公司，河北廊坊065000；3.河北农业大学，河北保定071000）

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的严重影响养禽业发展的重要传染病之一，病原属双RNA病毒科成员［1-3］。从IBDV发现至今，新的变异株及超强毒株不断出现，使得传统活疫苗和灭活疫苗已无法完全阻止IBD的发生和流行［4］，迫切需要开发更加安全、有效的新型疫苗，而且基因工程疫苗是未来发展方向［5］。目前，已知该病毒基因组共编码VP1、VP2、VP3、VP4和VP5 5种蛋白，其中VP2蛋白是宿主保护性免疫原，可诱导产生中和抗体，已成为近年来众多学者研究的热点［6-7］。本试验利用大肠埃希菌表达系统，表达出IBDV HB株VP2蛋白，探索其用于免疫预防的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及抗体 IBDV HB株由河北农业大学动物卫检实验室分离鉴定并保存，经生物学测定及VP2基因序列分析为中等毒力毒株，且经验证将其作为活疫苗接种雏鸡效果良好；鼠抗IBDV HB株阳性血清由河北北方学院动物传染病实验室制备；羊抗鼠HRP标记二抗购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 重组质粒 含有VP2完整基因序列的重组质粒pBS-VP2由河北农业大学动物卫检实验室构建，目的基因全长1542bp，并分别在上、下游引物引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 目的基因原核表达载体的构建 将含VP2基因的重组质粒pBS-VP2用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收目的片段；原核表达载体pET-32a-c（＋）做同样的酶切回收处理；二者连接后转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞，重组质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性重组表达质粒命名为pET-VP2。

1.2.2 VP2基因的表达 重组质粒pET-VP2转化表 达 菌 株 BL21（DE3），接 入 含 有 Amp（200μg／mL）的LB培养基，37℃振荡培养至OD 600nm到0.6，加入IPTG至终浓度1mmol／L，继续培养3h。表达蛋白参考文献［8］方法，用75g／L的SDS-PAGE、Western blot检测。

1.2.3 重组蛋白的大量表达 挑取重组菌单菌落接种于10mL含Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，接入2 000mL含Amp的LB液体培养基，按上述方法诱导表达。参考文献［8］，测定蛋白溶解性，纯化表达蛋白。

1.2.4 表达重组蛋白的动物免疫 表达的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后，凝胶在预冷的0.25mol／L KCl溶液浸泡2min，显示蛋白条带后，将目的蛋白条带切下纯化回收。将纯化的VP2蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，Balb／c小鼠背部皮下注射，每只小鼠50μg／只，共免疫6只。初次免疫后每2周加强免疫1次，第3次免疫接种后7d，断尾采血，分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价。

2 结果

2.1 重组表达质粒pET-VP2的酶切鉴定

对重组表达质粒pET-VP2用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切进行鉴定，结果切出两个条带，分别为载体片段和目的基因约1 500bp。结果表明，目的基因已连接到pET-32a-c（＋）表达载体上（图1）。

图1 重组表达载体pET-VP2双酶切鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant pET-VP2 by enzyme digestion

2.2 重组蛋白的表达

重组表达质粒转化表达菌株BL21经诱导表达后，SDS-PAGE分析，出现一条约55ku条带，与预期结果相符，而未诱导的载体及空载体pET-32a未出现这一条带（图2）。

2.3 Western blot鉴定分析

将目的蛋白和空载体表达的产物进行SDSPAGE，再转移到NC膜上，用鼠抗IBDV HB株阳性血清作为一抗与之进行特异性结合，再经过HRP标记的羊抗鼠IgG二抗显色反应，出现一条特异性的抗原抗体结合带，而空载体则没有，证明表达的目的蛋白是VP2蛋白，且具有良好的特异性和反应原性（图3）。

2.4 免疫小鼠抗重组蛋白血清效价的检测

将纯化后的重组蛋白以最佳包被浓度（1∶200，15μg／mL）包被96孔酶标反应板，按文献［9］方法，以加强免疫后的血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗，间接ELISA方法测定VP2蛋白免疫小鼠后血清抗体效价，并设阴性血清对照组，结果见表1。

［10］方法判定结果（P≥N＋3SD为阳性），经计算阴性血清的OD 490nm平均值为0.088，标准方差等于0.022，因此阴阳性的临界值为0.154（0.088＋3×0.022），即受检血清的抗体效价为OD 490nm值高于0.154的最高血清稀释倍数。

由表1可看出，在免疫小鼠中，产生的ELISA抗体效价可高可达1∶12 800，且大多数免疫小鼠抗体效价在1∶6 400以上。由此表明，体外表达的VP2蛋白免疫原性良好。

图2 大肠埃希菌中诱导表达的VP2融合蛋白Fig.2 The expression of VP2fusion protein in BL21（DE3）E.coli

图3 Western blot检测表达的目的蛋白Fig.3 VP2fusion protein identified by Western blot

表1 重组蛋白pET-VP2免疫接种小鼠后血清ELISA抗体效价（OD 490）Table 1 The ELISA titers of antibodies against recombinant protein pET-VP2in sera of mice after immunization（OD 490）

3 讨论

本研究使用pET-32a原核表达系统对IBDV HB株VP2蛋白进行表达。表达的融合蛋白分子质量约58ku。Western blot检测目的蛋白，用鼠抗IBDV HB株株的阳性血清作为一抗与之进行特异性结合，再经过 HRP标记的羊抗鼠IgG二抗的显色反应，目的蛋白处出现一条特异性的抗原抗体结合带，而空载体则没有，从而证明表达的目的蛋白是VP2蛋白，同时也表明重组蛋白具有反应原性。

本研究旨在探索用重组VP2蛋白预防传染性法氏囊病的可行性，纯化的重组蛋白免疫试验小鼠后，间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明，该重组蛋白能够刺激机体产生高水平的抗体，充分证明重组的VP2蛋白具有很好的免疫原性，为研制新型的IBD基因工程疫苗奠定了良好的基础，但其生产成本、免疫剂量及免疫佐剂等方面的问题都有待进一步解决。

参考文献：

［1］ 辛朝安.禽病学［M］.北京：中国农业出版社，2003：80-84.

［2］ Sun J H，Yan Y X，Jiang J，et al.DNA immunization against very virulent infectious bursal disease virus with VP2-4-3gene and chicken IL-6gene［J］.J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2005，52（1）：1-7.

［3］ Wu P C，Su H Y，Lee L H，et al.Secreted expression of the VP2protein of very virulent infectious bursal disease virus in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris［J］.J Virol Meth，2005，123（2）：221-225.

［4］ 单学强，李明义，高 轩.传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析［J］.动物医学进展，2012，33（5）：18-21.

［5］ 朱彩霞，朱瑞良，刘冠华，等.传染性法氏囊病超强毒株VP2基因原核表达及其免疫原性检测［J］.中国预防兽医学报，2011，33（2）：154-157.

［6］ 宋幸辉，王 睿，王选年，等.传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定［J］.畜牧兽医学报，2012，42（5）：692-697.

［7］ 唐应华，宫玉珍，王永伟，等.含禽流感病毒M2e氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2蛋白的免疫原性鉴定［J］.微生物学报，2012，52（52）：753-759.

［8］ 萨姆布鲁克J，拉塞尔D W..分子克隆实验指南［M］.黄培堂等，译.3版.北京：科学出版社，2002：96-98.

［9］ 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法［M］.北京：人民军医出版社，2000：18-22.

［10］ 谢芝勋，文艳玲，唐 熠，等.利用Hexon主要抗原性基因重组蛋白检测禽Ⅰ群腺病毒抗体ELISA方法的建立［C］.中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集，2009：1193-1195.