姜黄素通过内质网应激途径诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的实验研究＊

姜黄素（Curcumin）提纯自中药姜黄（Curcuma longa L．）的根茎，属于酚性色素，其化学名为阿魏酰甲烷（Difcruloylmethane）。中医认为姜黄具有祛风活血以及通络止痛等功效。从20世纪80年代至今，大量研究表明，姜黄素具有较强的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡［1－2］。近年研究表明，内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）是有别于线粒体途径及死亡受体途径的可诱导细胞凋亡的独立通路。本研究采用姜黄素对宫颈癌HeLa细胞进行干预，探讨姜黄素是否能够通过ERS途径诱导HeLa细胞凋亡，为姜黄素的临床应用提供新的依据。

材料与方法

1 材 料 宫颈癌细胞株HeLa购自中国科学院细胞库；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、姜黄素（C21H20O6，纯度≥98%）、ERS抑制剂4－苯基丁酸钠（4－PBA）购自美国Sigma－Aldrich公司；DMEM细胞培养基以及胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；Prime－Script RT Master Mix试剂盒以及SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒购自日本Takara公司；葡萄糖调节蛋白78（GRP78），C／EBP同源蛋白质（CHOP）以及β－Actin引物均由日本Takara公司合成；GRP78及CHOP抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；β－Actin抗体及辣根过氧化物酶标记二抗均购自美国Santa Cruz公司。

2 宫颈癌HeLa细胞培养 向DMEM培养基中加入10%FBS、0．1U／L链霉素以及0．1U／L青霉素制成细胞培养液对HeLa细胞进行培养。培养条件为37℃、饱和湿度以及5%CO2环境，隔天更换细胞培养液，细胞密度为80%以上时按照1∶3的比例对细胞进行传代，取处于对数生长期的HeLa细胞进行进一步试验。

3 MTT法检测姜黄素对HeLa细胞增殖的抑制作用 将HeLa细胞制成浓度为1×105／ml的细胞悬液，将该细胞悬液加入96孔板（GREINER，德国），共设6个平行孔，每孔加入100μl细胞悬液。6个平行孔中加入的姜黄素溶液（均由DMEM培养基配制）浓度分 别 为 0μmol／L（阴 性 对 照）、3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L 以及50μmol／L。干预48h后，向每孔中加入浓度为5mg／ml的 MTT溶液20μl继续培养4h，弃去上清液后加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，充分震荡后，使用酶标仪测定波长为570nm处的吸光度值（A值）。采用以下公式对细胞生长抑制率进行计算：细胞生长抑制率＝（1－样本平均A值／阴性对照平均A值）×100%。

4 试验分组 本研究中将细胞样本共分为对照组（Ctrl）、对照＋4－PBA组（Ctrl＋PBA）、姜黄素组（Cur）以及姜黄素＋4－PBA组（Cur＋PBA）。姜黄素浓度为下文MTT法中筛选出的姜黄素最适浓度；根据Kubota等 的 研 究［3］，选 择 3mmol／L 作 为 4－PBA 溶 液 （由DMEM细胞培养基溶解）的干预浓度。

5 流式细胞仪测定宫颈癌HeLa细胞凋亡 将各组样本细胞分别离心，采用含0．2%FBS的磷酸盐缓冲液（PBS）对细胞进行洗涤后加入70%乙醇溶液中固定，将各组样本细胞悬液浓度调整为1×106／ml后先后采用Anexin V及PI（BD，美国）进行双染，流式细胞仪（FACSCalibur，BD，美国）检测荧光强度后进行分析。

6 Real－time PCR 收集细胞样本后，采用 Trizol法提取总Mrna，紫外分光光度计检测纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性后，采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行逆转录合成cDNA，并以该cDNA为模板采用SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒进行Real－time PCR。GRP78、CHOP及β－Actin的引物序列［4］详见表1。扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，再以72℃延伸45s，共进行25个循环，最后再以72℃延伸10min。上述试剂盒使用均严格按照厂家说明书进行。以β－Actin mRNA表达水平作为内参，Bio－Rad IQ5（Bio－Rad，美国）软件对所得数据进行分析。

表1 Real－time PCR引物序列

7 Western Blotting 将样本细胞离心，PBS洗涤2次，采用加入PMSF（Santa Cruz，美国）RIPA裂解缓冲液（Santa Cruz，美国）对细胞进行处理，采用BCA法对获得的蛋白浓度进行测定后，加入等量1×SDSPAGE loading buffer，100℃ 变 性 5min 后 进 行 SDSPAGE垂直电泳，电转至PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭1h，一抗孵育过夜，充分洗涤后加入二抗（1∶5000）孵育2h，充分洗涤后，采用Super Signal West Pico化学荧光发光试剂盒（Thermo，美国）对所检测蛋白进行显影，X胶片曝光后，以β－Actin作为内参，采用Image－Pro Plus（Version 5．0．2）软件对结果进行分析。

8 统计学处理 本研究所得数据均采用（均数±标准差）表示，数据均录入Excel并采用统计学软件SPSS 17．0进行分析处理，统计方法为单因素方差分析，均以P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1 MTT法检测姜黄素对HeLa细胞的生长抑制率与姜黄素干预浓度确定 阴性对照HeLa细胞生长活跃，分 别 采 用 3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L以及50μmol／L浓度的姜黄素溶液对HeLa细胞干预48h后，细胞生长均受到不同程度的抑制，并呈现出浓度依赖性，与阴性对照相比具有统计学意义（P＜0．05）。本研究选取25μmol／L作为后续试验中姜黄素的干预浓度。见表2。

2 姜黄素对各组HeLa细胞凋亡的影响 在流式细胞分析图上，正常细胞处于Q3区，早期凋亡细胞处于Q4区，晚期凋亡细胞／坏死细胞处于Q2区，细胞碎片则处于Q1区。处于（Q2＋Q4）区的细胞占细胞总数的百分比即为细胞凋亡诱导率。本研究发现，Ctrl组、Ctrl＋PBA组、Cur组以及Cur＋PBA组凋亡诱导率分别为4．15%、5．22%、68．37%以及49．28%。与Ctrl及Ctrl＋PBA组相比，Cur组HeLa细胞凋亡诱导率显著升高（P＜0．05）；与Cur组相比，Cur＋PBA组HeLa细胞凋亡率显著降低（P＜0．05）。见图1。

图1 流式细胞术检测各组HeLa细胞凋亡情况比较

3 姜黄素对各组HeLa细胞GRP78及CHOP mRNA表达的影响 本研究发现，与Ctrl组及Ctrl＋PBA组相比，Cur组GRP78及CHOP mRNA表达水平均显著升高（P＜0．05）；与Cur组相比，Cur＋PBA组GRP78及CHOP mRNA表达水平均显著降低（P＜0．05）。见图2。

4 姜黄素对各组HeLa细胞GRP78及CHOP蛋白表达水平的影响 本研究发现，与Ctrl组及Ctrl＋PBA组相比，Cur组GRP78及CHOP蛋白表达水平均显著升高（P＜0．05）；与Cur组相比，Cur＋PBA组GRP78及CHOP蛋白表达水平均显著降低（P＜0．05）。见图3。

表2 不同浓度姜黄素溶液对HeLa细胞生长抑制的情况（48h）

图2 姜黄素对各组HeLa细胞GRP78及CHOP mRNA水平的影响

图3 姜黄素对各组HeLa细胞GRP78及CHOP蛋白表达水平的影响

讨 论

作为发病率仅次于乳腺癌的第二大女性恶性肿瘤，宫颈癌对女性健康危害极大。目前，对于早期宫颈癌，临床治疗以手术切除为主，而对于中晚期患者，化学治疗等药物治疗则成为主要治疗方式。虽具有较强的抗肿瘤活性，但化学治疗药物具有细胞毒性大、不良反应多等缺点，因此具有高效低毒特点的抗肿瘤药物具有广阔的应用前景。姜黄素为中药姜黄的主要有效成分，研究表明除具有抗炎、抗脂质过氧化、降血压以及抗纤维化等药理活性外［5］，近年越来越多的研究表明，姜黄素还具有显著的抗肿瘤活性，对人肝癌细胞SMMC7721、乳腺癌、人类白血病细胞 HL－60以及人舌癌细胞Tca8113等细胞系均具有显著的抑制作用，能够诱导肿瘤细胞出现显著的凋亡［6］。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是有别于细胞坏死的细胞死亡方式。诱导肿瘤细胞凋亡是多种化疗药物的共同作用机制，可以作为药物抗肿瘤能力的衡量标准之一。已经有研究证实，姜黄素不但能抑制宫颈癌细胞系Siha在体内、外的增殖，而且姜黄素能够诱导宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、CaSki以及C33A发生明显凋亡［7－8］。本研究通过 MTT法及流式细胞术证实，姜黄素不但对宫颈癌细胞系HeLa增殖具有显著的抑制作用，而且能够诱导其发生凋亡，这与既往文献报道一致。

一般认为，内、外因素能够通过线粒体途径、死亡受体途径以及ERS途径诱导细胞凋亡。ER是重要的细胞器，是新生蛋白质合成与加工的重要场所，对维持细胞内环境稳定与正常功能具有关键作用。在不良信号的刺激下，内质网所发生的钙离子平衡失调以及未折叠蛋白反应（UPR）等，称为ERS［9］。严重而持续的ERS可直接导致细胞凋亡的发生。作为定位于内质网内的折叠伴侣蛋白，GRP78被认为是ERS发生的主要分子标志之一［10］。ERS发生可最终导致转录因子CHOP的活化，作为ERS诱导凋亡信号通路下游的关键分子，表达增高的CHOP不仅可抑制抗凋亡蛋白BCL－2的表达，而且能够促进促凋亡蛋白BAX／BAK的表达，最终诱发Caspase分子级联反应，DNA内切酶PARP活化，后者使细胞核内的DNA降解，细胞发生凋亡［11］。4－PBA属于低分子量游离脂肪酸的一种，是一种用于治疗鸟氨酸循环障碍疾病的经典药物。新近研究表明，作为一种化学伴侣，4－PBA对ERS可起到抑制作用［12］。

本研究发现，使用姜黄素处理HeLa细胞后，在发生增殖抑制及细胞凋亡的同时，HeLa细胞内GRP78及CHOP在转录水平及翻译水平表达增高，提示姜黄素可通过内质网应激途径诱导HeLa细胞凋亡。本研究进一步发现，在使用姜黄素对HeLa细胞进行干预后，使用ERS抑制剂4－PBA能够显著降低HeLa细胞的凋亡率，同时HeLa细胞内内质网应激标志物GRP78与凋亡诱导分子CHOP的mRNA及蛋白表达水平均被显著抑制，该结果进一步说明姜黄素能够通过激活ERS相关通路诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。

［1］ 朱 青，张王刚，刘苏虎，等．姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究［J］．陕西医学杂志，2005，34（10）：1185－1186，1192．

［2］ Anand P，Sundaram C，Jhurani S，et al．Curcumin and cancer：an“old－age”disease with an“age－old”solution［J］．Cancer Lett，2008，267（1）：133－164．

［3］ Kubota K，Niinuma Y，Kaneko M，et al．Suppressive effects of 4－phenylbutyrate on the aggregation of Pael receptors and endoplasmic reticulum stress［J］．J Neurochem，2006，97（5）：1259－1268．

［4］ Chen J，Wei H，Xie B，et al．Endoplasmic reticulum stress contributes to arsenic trioxide－induced apoptosis in drugsensitive and－resistant leukemia cells［J］．Leuk Res，2012，36（12）：1526－1535．

［5］ Kuo JJ，Chang HH，Tsai TH，et al．Positive effect of cur－cumin on inflammation and mitochondrial dysfunction in obese mice with liver steatosis［J］．Int J Mol Med，2012，30（3）：673－679．

［6］ Masuelli L，Benvenuto M，Fantini M，et al．Curcumin induces apoptosis in breast cancer cell lines and delays the growth of mammary tumors in neu transgenic mice［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2013，27（1）：105－119．

［7］ Singh M，Singh N．Curcumin counteracts the proliferative effect of estradiol and induces apoptosis in cervical cancer cells［J］．Mol Cell Biochem，2011，347（1－2）：1－11．

［8］ 邓怀慈，韩苏夏，陈 谦．姜黄素对人宫颈癌Hela细胞放射敏感性影响的实验研究［J］．陕西医学杂志，2004，33（5）：393－394．

［9］ Cao SS，Kaufman RJ．Targeting endoplasmic reticulum stress in metabolic disease［J］．Expert Opin Ther Targets，2013，17（4）：437－448．

［10］ Xu YY，You YW，Ren XH，et al．Endoplasmic reticulum stress－mediated signaling pathway of gastric cancer apoptosis［J］．Hepatogastroenterology，2012，59（120）：2377－2384．

［11］ Guo FJ，Liu Y，Zhou J．XBP1Sprotects cells from ER stress－induced apoptosis through Erk1／2signaling pathway involving CHOP［J］．Histochem Cell Biol，2012，138（3）：447－460．

［12］ Kim DS，Li B，Rhew KY，et al．The regulatory mechanism of 4－phenylbutyric acid against ER stress－induced autophagy in human gingival fibroblasts［J］．Arch Pharm Res，2012，35（7）：1269－1278．