运动性疲劳对大鼠脑组织内HDAC2表达的影响＊

西安体育学院运动医学教研室（西安710068） 张葆欣 刘远新 苗常青

研究表明，HDAC2（组蛋白脱乙酰基酶2）是学习和记忆功能的负调控因子，研究用小鼠基因获得或缺失功能模型具体阐明了HDAC2的抑制记忆形成。HDAC2在脑部的过表达能减少树突棘和神经元的密度、突触数及突触可塑性，相反如果脑部的HDAC2缺乏能导致突触的数量增加，从而促进记忆形成［1］。HDAC2是1996年首先由Yang等［2］从人的Hela细胞cDNA文库筛选得到的，它与另外2个哺乳动物的组蛋白脱乙酰基酶HDAC1和HDAC3具有相似的结构和某些相同的功能，属于同一家族。它们共同存在于细胞中，但各个组蛋白脱乙酰基酶也有其不同的功能。HDAC2被认为与在神经可塑性及记忆中所涉及的基因相关联。本实验采取10d游泳运动建立动物的疲劳模型［3］，通过避暗穿梭法检测大鼠学习记忆功能受损情况，同时检测大鼠大脑皮层、海马CA1区内HDAC2蛋白表达，从而为阐明运动性疲劳所致大鼠学习记忆障碍的发病机理提供实验依据。

材料与方法

1 实验动物及分组 选用2月龄成年雄性SD大鼠24只，体重200～250g，SPF级，活动能力相近，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。购入后随机分为3组，正常对照组（NC）、运动后疲劳即刻组（FC）和运动疲劳后恢复90min组（FR）。动物房由固定的专门人员进行饲养，室温控制在20℃～25℃，湿度40%～60%。自然节律采光，均喂饲普通饲料，自由饮水和进食。

2 大鼠运动性疲劳模型的建立 购入后适应性饲养1周后通过游泳训练的方式建立SD大鼠的运动性疲劳模型。NC组大鼠不进行任何的游泳训练，运动组动物在建模型之前先适应性游泳3d。训练在120cm×65cm×85cm大游泳桶中进行，保持水深80cm，水温（24±2）℃，每天1次训练，每次约20min。3d适应性训练后开始建立10d正式训练，前7d每天1次训练，持续3h；最后2d每天2次训练，2次训练间隔6h。建模期间要时刻观察大鼠体重、活动状态及运动能力的变化以准确判断疲劳的程度。

3 避暗穿梭实验 采用避暗穿梭测试仪，将大鼠放在明暗对比明显两个相通的箱室（有隔板分开）时。当大鼠在明箱适应30s后人为的打开通道，一进入暗箱时立刻施加电击从而获得记忆。24h后再将大鼠放入明箱，记录从放入明箱到第一次钻洞进入暗箱的时间即潜伏期，同时记录其进入暗箱的错误次数。以300s的时间为限，若300s内不进入暗箱则该大鼠的记忆保持良好。同时24h后检测首次进入暗室的时间（潜伏期）和进入暗室的次数（错误次数），以评价大鼠的记忆能力。

4 HDAC2蛋白的免疫组织化学实验 采用腹腔麻醉（巴比妥钠）大鼠，经心脏快速灌注冲洗约250ml生理盐水，选用4%多聚甲醛约500ml（PBS配制，pH7．4）进行灌注冲洗固定，然后取全脑经4%多聚甲醛进行后固定约20h，再进行脱水、包埋、切片，按照HDAC2蛋白免疫组化染色试剂盒说明采用SABC法进行染色操作。

5 统计学分析 分析选用Olympus显微镜与计算机影像系统相结合，从每只大鼠脑片中随机选取5张，同时在大脑皮层和海马CA1区各选5个视野分别对各组染色切片中HDAC2蛋白阳性表达进行定量分析，于各个视野下计算阳性细胞的积分光密度（IOD）值，并取5个视野下的IOD之和。获取数据以±s表示。采用SPSS16．0统计软件包进行单因素方差分析，方差不齐时用秩和检验。

结 果

1 大鼠的一般情况 10d的疲劳模型成功建立后NC组表现为体重增长，活动状况良好。FC、FR组多数大鼠出现精神不佳，体重增长慢，活动及觅食减少，毛发无光泽等状况。

2 避暗穿梭实验 见表1。FC组与NC组相比，大鼠避暗潜伏期缩短，错误次数增加，统计学上有显著性差异。FR组避暗潜伏期和错误次数较FC组有所恢复，但与NC组相比仍有显著差异。表明本实验设计的运动性疲劳致大鼠学习记忆障碍模型基本建立成功。

表1 不同组别大鼠避暗穿梭实验结果（n＝8，±s）

表1 不同组别大鼠避暗穿梭实验结果（n＝8，±s）

注：与NC组相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

组 别 n 避暗潜伏期（s） 错误次数（次）8 215．5±23．5 2．1±0．3 FC组 8 64．3±8．5＊＊ 8．5±2．1＊FR组 8 109．7±8．3＊＊ 6．9±0．8 NC组＊

3 脑内HDAC2免疫阳性细胞的表达与分布

见表2。HDAC2在大鼠的大脑皮层和海马神经细胞的胞核均有表达。NC组大鼠大脑皮层和海马HDAC2蛋白胞核着色淡；FC组和FR组大鼠的大脑皮层及海马HDAC2蛋白表达与NC组比明显上调且有显著性差异，胞核的着色较深，呈棕黄或棕褐色。

表2 不同组别大鼠大脑皮层及海马HDAC2蛋白免疫组化结果（±s）

表2 不同组别大鼠大脑皮层及海马HDAC2蛋白免疫组化结果（±s）

注：与NC组相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

组44．0±5．5 45．0±4．1 FC组 75．2±4．5＊ 76．7±6．5＊FR组 60．7±4．0＊＊ 63．1±5．9大脑皮层 海马NC组别＊

讨 论

研究显示HDAC2主要位于细胞核内，是联系健康和疾病的一个关键因素，在胚胎的发育中起着关键的作用，是影响免疫反应有关的细胞因子信号，在实体瘤中常常呈过表达趋势［4］。同时HDAC2在成熟的神经元突触传递中也起着重要的作用［5－6］。近年来关于HDAC2与学习记忆功能的研究越来越多，HDAC2对学习与记忆的功能可能起负调控作用。

本实验研究显示FC组大鼠避暗潜伏期缩短，错误次数出现相应增加，同NC组相比差异显著；而FR组大鼠避暗潜伏期、错误次数与FC组相比均有所恢复，但与NC组相比差异仍显著。提示运动性疲劳可能明显损害SD大鼠的学习记忆功能。

本实验取材部位均是参与学习记忆功能的重要脑区（大鼠大脑皮层及海马CA1区），实验结果显示FC组大脑皮层及海马CA1区内的HDAC2表达显著上调，FR组HDAC2表达水平较疲劳后即刻有所恢复，但与NC组相比仍有显著差异，提示运动性疲劳后大鼠的学习记忆能力可能出现显著下降。疲劳即刻和恢复90min组大鼠学习记忆功能均有不同程度的损伤，而HDAC2表达上调可能是其损害学习记忆功能的重要突触机制之一，且这种损害作用在短期内得不到很好的恢复。由此我们可以推断运动性疲劳致大鼠学习记忆功能损伤可能与大鼠大脑皮层和海马内HDAC2蛋白的表达变化相关，其具体的机制还有待进一步的研究阐明。

［1］ Guan JS，Haggarty SJ，Giacometti E，et al．HDAC2negatively regulates memory formation and synaptic plasticity［J］．Nature，2009，459（7243）：55－60．

［2］ Yang WM，Inouye C，Zeng YY，et al．Transcriptional repression by YY1is mediated by interaction with a mammalian homolog of the teast global regulator RPD3［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：12845－12850．

［3］ 侯莉娟，刘晓莉，乔德才．大鼠游泳运动疲劳模型建立的研究［J］．实验动物科学与管理，2005，22（1）：1－3．

［4］ Kramer OH．HDAC2：a critical factor in health and disease［J］．Trends Pharmacol Sci，2009，30（12）：647－655．

［5］ Montgomery RL，Hsieh J，Barbosa AC，et al．Histone deacetylases 1and 2control the progression of neural precursors to neurons during brain development［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（19）：7876－7881．

［6］ Akhtar MW，Raingo J，Nelson ED，et al．Histone deacetylases 1and 2form a developmental switch that controls excitatory synapse maturation and function［J］．J Neurosci，2009，29（25）：8288－8297．