子宫内膜轻创术对子宫内膜容受相关因子表达的影响＊

江苏省常州市妇幼保健院生殖中心（常州213003） 黄晓阳 陈 莉 杨海燕 许培箴 邢宝玲

子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即子宫内膜处于一种允许胚胎粘附，穿透并使胚胎间质发生改变从而使胚胎着床的状态，直接影响胚胎能否种植成功［1］，是一个涉及到胚胎组织和子宫内膜之间多种细胞因子和生长因子的复杂多阶段的过程。目前IVF着床失败病例中有三分之二是因为子宫内膜容受性的原因［2］。近年来如何改善子宫内膜容受性已经成为研究的热点，其中包括子宫内膜轻创术［3］，但是其作用机理尚不清楚，什么时间进行轻创是最佳时机也无定论。本研究通过电子显微镜和分子生物学方法观察轻创前后及不同时间轻创后着床期子宫内膜胞饮突、整合素β3、同源框基因（HOXA－10）表达的变化，以探讨轻创术对提高子宫内膜容受性的作用及在月经早卵泡期、中卵泡期和晚卵泡进行轻创术的差异。

资料与方法

1 一般资料 选择2010年1月至2011年10月，我院行IVF不孕患者90例，均签署有关知情同意书。病例纳入标准：年龄22～38岁；有规律排卵；不孕原因为输卵管因素，男方因素，且经宫腔镜或子宫输卵管碘油造影排除子宫因素，无子宫内膜息肉；助孕周期前3个月内未口服避孕药或放置宫内节育器；助孕周期前1年内无流产、分娩、诊刮或盆腔感染；既往有过一次宫内妊娠，全部患者妇科检查无阴道炎症，无结核病史。90例随机分为3组：A组（30例）：月经第3天对子宫内膜进行行轻创术，B组（30例）：月经第7天对子宫内膜进行轻创术，C组（30例）：月经第11天对子宫内膜进行轻创术，所有患者均在轻创前1周期和轻创周期排卵后7d行子宫内膜微活检术获取子宫内膜。3组临床相关数据比较，无统计学差异（P＞0．05），见表1。

表1 3组轻创组临床相关数据（±s，n＝30）

表1 3组轻创组临床相关数据（±s，n＝30）

31．2±2．1 32．5±1．9 31．9±1．5不孕原因输卵管 18（60%） 16（53．33%） 15（50%）男性 10（33．33%） 12（40%） 10（33．33%）其它 2（6．67%） 2（6．67%） 5（16．6%）不孕时间（年） 4．2±1．2 5．1±1．3 4．8±1．6排卵日内膜厚度（mm）A B C年龄指 标10．1±1．5 11．4±1．6 10．5±1．7

2 方 法 ①子宫内膜轻创术：常规消毒铺巾，在B超引导下，由专人用特小号刮匙表浅地搔刮宫腔各面。②子宫内膜微活检术：排卵后7d，常规消毒铺巾，用直径3mm的宫腔组织吸引管（立可灵）进入宫腔底部，向外抽内芯，利用其负压作用，自宫腔底部及宫壁多处取得微量内膜组织待用。③卵泡超声检查：采用B型超声诊断仪（ALOKA）进行自然周期卵泡监测，阴道探头频率7．5MHz，由专人操作，所有患者均于月经第12天开始接受检查，当优势卵泡达到15mm，开始每天监测B超，直至卵泡成熟及排卵。④将待用的每份新鲜子宫内膜标本用生理盐水反复冲洗分为2份，1份放入4%戊二醛固定备做扫描电镜观察胞饮突，另一份放入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，用作免疫组化检测整合素β3、HOXA－10。

3 观察项目 ①扫描电镜胞饮突观察：每份标本由2人同时观察20个视野，选取其中有代表性的5帧，按Nikas等的方法，计算内膜表面被覆胞饮突面积的百分比，＜20%为较少，20%～50%为中等，＞50%为丰富，每例标本的结果为5帧画面的平均值。②免疫组化检测：采用SP法检测整合素β3、HOXA－10蛋白在子宫内膜的表达，免疫组化的方法按照试剂盒说明书进行。兔单克隆抗体整合素β3为宜百康生物科技股份有限公司产品，兔多克隆抗体HOXA－10为上海玉博生物科技有限公司产品，根据Watanabe免疫组化半定量评分标准评分，高倍镜下连续观察5个视野（200倍），视野里棕黄色颗粒为阳性着色，按细胞比率和染色的强度分为5个级别：阳性细胞＜5%，未被染色为阴性（－），计为0分；阳性细胞5%～15%，呈浅棕色为弱阳性（±），计为1分；阳性细胞15%～30%，棕色为阳性（＋），计为2分；阳性细胞30%～50%，深棕色为阳性（2＋），计为3分；阳性细胞＞50%，棕褐色为强阳性（3＋），计为4分。

4 统计学方法 采用用SPSS13．0统计软件包分析结果，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 胞饮突、整合素β3、HOXA－10结果 见表2，图1～2。术后胞饮突表达较术前更为丰富，整合素β3，HOXA10表达较术前增强，结果有统计学差异（P＜0．05）。扫描电镜：所有子宫内膜标本都可以发现胞饮突的阳性表达，位于面向子宫宫腔的上皮细胞顶端膜表面，发育完全的胞饮突大小一致，边界清楚，其表面的微绒毛消失而变得光滑，呈蘑菇样外观。但术前多为发育中胞饮突，发育完全胞饮突所占比例较少；轻创术后胞饮突发育更为完全，微绒毛少，表面光滑。免疫组化观察结果：子宫内膜免疫组化结果在光学显微镜下观察可见，轻创术前腺体少，血管少，腺腔内无分泌物，间质致密，内膜腺体与间质发育不同步，轻创术后腺体明显增多，血管充盈明显，腺体发育与间质同步。整合素β3表达在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞胞膜和胞浆上；HOXA10表达于子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞核中，轻创术后两者的表达均比轻创术前有明显地增强（P＜0．05）。

表2 轻创术前后子宫内膜胞饮突、整合素β3、HOXA10表达自身对照（n＝90）

图1 轻创术前后子宫内膜整合素β3表达（免疫组化SP法×400）

图2 轻创术前后子宫内膜HOXA－10表达（免疫组化SP法×400）

2 不同时间轻创术后子宫内膜胞饮突、整合素β3、HOXA10表达比较 见表3～4。轻创术前3组胞饮突，整合素β3，HOXA10表达无统计学差异（P＞0．05）；术后A组三者的表达明显高于B组和C组，结果有统计学差异（P＜0．05）

表3 3组轻创术前胞饮突、整合素β3、HOXA10表达的比较（n＝30）

表4 3组轻创术后胞饮突、整合素β3、HOXA10表达的比较（n＝30）

讨 论

1 轻创术对子宫内膜容受性的影响 子宫内膜容受性可以从形态学，超声学及分子生物学等方面进行评价。在子宫内膜形态学方面，胞饮突作为子宫内膜容受性的指标已经被众多学者证实，它是植入窗口期子宫内膜上皮细胞顶端出现的大而平滑的胞状突起，有研究组已证实胚胎均着床在出现胞饮突的区域，并粘附在有胞饮突细胞的顶端［4］，胞饮突在人类子宫内膜中出现在月经的第20～21d，持续时间非常短暂，大约在48h后消退，而这一时期正好与胚胎着床的窗口期相吻合［5］。本研究中取的均是排卵后一周的子宫内膜标本，正好是子宫内膜着床的窗口期，电子显微镜发现所有的标本中均有胞饮突出现，只是其分布和发育程度有差异。整合素β3和HOXA10是近几年研究比较多的与子宫内膜容受性相关的因子。整合素β3是一类细胞外基质糖蛋白，属于粘附分子超家族，由αβ两个亚单位组成，介导细胞间及细胞和细胞外基质间的粘附和信息传导。其中整合素β3表达于黄体中期的子宫内膜，与子宫内膜植入窗的开放同步［6－7］。HOXA属于多基因家族，是胚胎组织形态的主要调控基因，其中对胚胎着床影响最大的是HOXA10基因，属于腹部B组HOX基因，染色体定位于7p15～p14．2，mRNA全长2691bp，编码785个氨基酸，是子宫内膜着床调控必不可少的基因［8］。HOXA10蛋白在子宫内膜上的表达仅限于腺上皮和间质细胞中，随着月经周期的变化出现周期性，在着床窗口期的表达明显上升，与血液中孕酮值升高一致［9］。并且最近研究发现，HOXA10通过和一个含41bp的调控元件的结合直接上调整合素β3的表达，HOXA10与整合素β3表达峰值时相一致［10］。本研究中，以患者轻创前后作自身对照，消除组间影响因素，较为客观。结果显示，轻创术后胞饮突，整合素β3，HOXA10表达比术前明显增强，说明清创术可以提高这三者的表达，而这三种因子与子宫内膜容受性有密切的联系，进一步证实了轻创术可以提高子宫内膜的容受性。

2 轻创术对提高子宫内膜容受性作用的机制 子宫内膜轻创术可以刺激子宫内膜，提高子宫内膜容受性的机制不明。早在1907年，有报道对准备受孕的豚鼠的子宫内膜进行搔刮，可刺激子宫内膜细胞的快速生长，并诱导其蜕膜化［11］。有大鼠试验证实子宫内膜局部机械损伤可以使子宫内膜组胺释放增加，继而诱导内膜蜕膜化［12］。通过本研究结果，我们推测子宫内膜轻创术是一种机械刺激，可清除不规则增生组织，促进子宫内膜小动脉生成，改善子宫内膜局部血供，从而增加子宫内膜的容受性，并且轻创术后，着床相关因子表达明显增加，可以提高胚胎着床的机会。

3 行轻创术的时间、方法和可行性 目前，临床对胚胎移植中进行轻创术可以改善子宫内膜容受性已有一定的认识，但是在什么时间进行轻创术没有达成共识。本研究将轻创术分为在早卵泡期，中卵泡期和晚卵泡期进行，研究在不同时期进行轻创术后着床相关因子的变化，结果发现在早卵泡期组进行轻创术后着床相关因子表达最强，提示有可能在早卵泡期进行轻创最有利于子宫内膜容受性的改善。在早卵泡期进行搔刮，有利于子宫内膜的修复和同步化，而且轻创术用特小号刮匙，均在B超引导下进行，动作轻柔，宫腔各壁都有刺激，最小力度最大范围地对子宫内膜进行刺激，在严格无菌操作下无一例发生感染，研究证实这种轻创是有效和安全的，具有一定的可行性。由于本研究样本量小，对于在什么时间进行轻创术是最佳时机，尚需要更加深入，细致和全面大样本的研究。

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