慢性睡眠剥夺对CAS大鼠冠状动脉狭窄程度的影响

彭贵海，黄琪，陈玲玲，张雨馨，王治校，谭利＊

（1.湖北医药学院附属太和医院心内科，十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院，十堰 442000）

睡眠是人类生命活动的重要组成部分，对维持个体生存和正常心理、生理节律起着至关重要的作用。慢性睡眠剥夺（chronic sleep deprivation，CSD）指每日睡眠＜5h，持续3个月以上。CSD既是一种慢性应激，也是一种氧化应激，它已成为一个突出的医疗和公共卫生问题［1，2］。冠状动脉粥样硬化（coronary atherosclerosis，CAS）是一个动态发展的病理过程，主要表现为冠状动脉及其分支内膜类脂质沉着、复合糖类积聚，继而出现纤维组织增生、钙沉着和动脉中层病变，以及管腔逐渐狭窄。CSD、CAS的研究较多，但将两者结合起来研究的文献［3，4］甚少。本实验利用CSD对CAS模型大鼠实施应激，探讨CSD对CAS大鼠冠状动脉狭窄进展程度的影响及其可能机制，为临床防治冠心病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 实验动物 健康Sprage－Dawley（SD）大鼠96只，SPF级，3～4月龄，体质量210～260g，雌雄各半，由湖北医药学院实验动物中心［许可证号：SCXK（鄂）2005－0008］提供。

1.1.2 实验试剂 Vit D3注射液购自上海通用药业股份有限公司，胆固醇购自成都科龙化工试剂厂，猪胆盐购自广州环凯微生物有限公司，丙基硫氧嘧啶片购自南通精华制药有限公司，猪油自制。白细胞介素－1β（Interleukin－1β，IL－1β）试剂盒、白细胞介素－6（Interleukin－6，IL－6）试剂盒购自武汉博士德生物化学技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 实验动物随机分为4组，正常对照组24只，CSD组24只，CAS模型组24只，CAS合并CSD组24只。4组实验环境相同，单笼喂养，予灯光模拟黑夜和白天，给予灯光12h／d，在实验开始后有1w的适应期，均给予正常喂食，让动物熟悉环境。

1.2.2 CAS动物模型制备［5］CAS组和 CAS合并CSD组喂饲高胆固醇饲料（4%胆固醇、10%猪油、5%白糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、80.3%基础饲料），并在饲养开始时，腹腔注射VitD32 mL／kg（60万IU／kg）。12w 后，随机抽取10%大鼠，取冠状动脉做病理切片，苏木素－伊红（HE）染色；光镜下观察，有80%大鼠出现典型动脉粥样硬化斑块，即表明CAS大鼠模型建立成功。

1.2.3 睡眠剥夺实施［1，2］利用小平台水环境法，对CSD组和CAS合并CSD组大鼠进行睡眠剥夺。制作30cm×30cm×30cm睡眠剥夺箱，内置一直径为6cm的小平台，小平台周边注满水（水温维持在24℃左右），水面距平台面约1cm；于小平台上方14cm处放置笼盖，上面放置水和食物；大鼠在小平台上可以自由饲食饮水，但只能在小平台上屈曲而立；若睡眠则因伴随全身肌肉松弛和节律性垂头，大鼠落入水中而惊醒，再爬上站台。用此方法，1d实施20h、持续剥夺大鼠睡眠12w。与此同时，为排除隔离、限制活动和水环境造成的应激影响，我们为正常对照组、CAS模型组设立了大平台，其直径为18cm，大鼠在平台上可以睡眠，其他环境与CSD组和CAS合并CSD组相同。每天换水并打扫实验箱。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 旷场实验（open field test，OFT）［4］睡眠剥夺12w后，实施OFT，观察4组大鼠跨格次数（三爪以上跨入邻格的次数）、直立次数（两前肢离地1cm以上的次数或理毛的次数）以及排便量（以旷场试验结束后排便的颗粒数来表示）。

1.3.2 检测血清致炎因子 睡眠剥夺12w后，将4组大鼠麻醉，开胸于右心室，插管取血6mL，放入预先加入抗氧化剂的试管中，摇匀，静置30min后，3 000rpm离心10min（SIGMA离心机，离心半径13.5cm，1 358.37g），取血清，放入－20℃冰箱保存待测。采用放射免疫法、GC－1500型γ放射免疫计数器以及相关试剂盒检测血清致炎因子，严格按照试剂盒说明操作。

1.3.3 病理学检查 睡眠剥夺12w后，取4组大鼠冠状动脉做病理切片，HE染色，观察典型动脉粥样硬化斑块以及管腔狭窄程度的变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料统计描述用均数±标准差（±s）表示，采用t检验处理或进行方差分析，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠在OFT中情感行为变化

与正常对照组比较，CAS模型组跨格次数、直立次数及粪便粒数明显增多（P＜0.05）；与CAS模型组比较，CAS合并CSD组亦明显增多（P＜0.05）；CSD组多于正常对照组，少于CAS模型组（P＜0.05）（见表1）。

表1 4组大鼠旷场实验得分比较（±s）

表1 4组大鼠旷场实验得分比较（±s）

与CAS模型组比较，＊P＜0.05

?

2.2 4组大鼠血清致炎因子检测结果

与正常对照组比较，CAS模型组IL－1β（ng／L）、IL－6（pg／mL）水平明显增高（P＜0.05）；与CAS模型组比较，CAS合并CSD组亦明显增高（P＜0.05）；CSD组高于正常对照组，低于CAS模型组（P＜0.05）（见表2）。

表2 4组大鼠血清致炎因子水平比较（±s）

表2 4组大鼠血清致炎因子水平比较（±s）

与CAS模型组比较，＊P＜0.05

?

2.3 4组大鼠病理学检查结果

与正常对照组比较，CAS模型组CAS斑块出现率、冠状动脉狭窄程度明显升高（P＜0.01）；与CAS模型组比较，CAS合并CSD组亦明显升高（P＜0.05）；CSD组高于正常对照组，低于CAS模型组（P＜0.05）（见表3）。

3 讨论

CHD是一种生活方式病，其发生、发展和转归与其个体的生活习性密切相关。本研究结果显示，与CAS模型组比较，CAS合并CSD组跨格次数、直立次数及粪便粒数明显增多。这一结果说明CAS模型组大鼠处于较高状态的焦虑水平，CSD进一步加重了CAS大鼠的焦虑行为。

表3 4组大鼠病理学检查结果比较（±s）

表3 4组大鼠病理学检查结果比较（±s）

与CAS模型组比较，＊P＜0.05

?

本研究结果显示，CAS合并CSD组IL－1β、IL－6水平明显高于CAS模型组。此结果表明CAS模型组大鼠血清IL－1β、IL－6水平较高，CSD应激进一步促进血清IL－1β、IL－6浓度升高。血清IL－1β、IL－6水平升高，可能通过以下途径参与冠心病的发生发展［6］：1）刺激其他粘附分子（如ICAM－1、VCAM－1）及其它细胞因子的表达，促进炎症反应；2）刺激肝脏产生CRP急性炎症因子，促进血栓形成；3）以自分泌的方式刺激血管平滑肌细胞增生；4）炎症反应发生时，促进巨噬细胞表面低密度脂蛋白胆固醇（LDL）受体的合成及巨噬细胞对LDL的作用，从而加速脂质的沉积及粥样硬化斑块的形成等。IL－1β、IL－6是主要的致炎刺激因子，是心血管疾病的重要危险因素，在心血管疾病的发生、发展及预测方面具有重要意义［7］。

本研究病理学检查结果显示，CAS合并CSD组CAS斑块出现率、冠状动脉平均狭窄程度明显高于CAS模型组。因此，CSD可以通过刺激大鼠焦虑状态、致炎因子的产生促进CAS斑块形成，从而加快冠状动脉狭窄进展程度，提示我们要把“稳定患者正常睡眠”作为冠心病防治的常规手段来实施［8］。

［1］李娜，赵兴蓉，龚雪梅，等.慢性应激对大鼠冠状动脉粥样硬化病变及相关因素的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2008，16（6）：449－452.

［2］徐锋，李结华，唐海沁，等.冠心病患者抑郁焦虑状况及治疗进展［J］.临床医学，2012，32（6）：110－112.

［3］药红梅，吕吉元.PM2.5不同成分致冠状动脉粥样硬化大鼠炎症作用的探讨［J］.环境与职业医学，2010，27（11）：673－676.

［4］李志尚，潘宗奇，陈伯钧，等.焦虑情绪大鼠血脂水平分析［J］.广东医学，2010，31（10）：1251－1253.

［5］陈长香，李建民，李淑杏，等.睡眠剥夺对大鼠海马区c－fos和IL－1β表达影响［J］.中国公共卫生，2011，27（10）：1314－1315.

［6］张亚晶.睡眠剥夺对大鼠心脏的影响及其机制研究［D］.北京：军医进修学院，2009.

［7］方舟.睡眠剥夺对心脏部分功能的影响和机制研究及其药物干预［D］.北京：军医进修学院，2011.

［8］白婧.部队战士24小时睡眠剥夺后心率变异、血压及血清内分泌激素水平变化［D］.北京：军医进修学院，2012.