能力验证样品中沙门氏菌的分离与鉴定

游勇来 赵琼 陈志耿

(从化出入境检验检疫局 广东从化 510900)

1 前言

沙门氏菌(Salmonella sp.)是一群形态、培养、生化反应和抗原构造类似的革兰氏阴性杆菌，属于需氧或兼性厌氧菌，种类繁多，广泛分布于自然界，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径传播，没有中间宿主，能引起人和动物伤寒、副伤寒和食物中毒，临床表现为急性肠胃炎症，有突发性剧烈头痛、腹泻、呕吐、感觉不适和体温升高等［1］。世界上，每年由沙门氏菌引起的食物中毒病例多达几千万;在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒占首位，而且由其引起的动物感染也十分严重，已引起各界学者的广泛重视［2］。

为了加强实验室的能力建设，提高对致病菌的检测水平，确保检验结果的准确性，2012年我局综合实验室参加了由CNAS组织的牛肉中沙门氏菌的能力验证测试，现将参加本次能力验证测试中沙门氏菌的分离与鉴定过程及结果进行总结报告如下。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

能力验证样品：编号分别为 093、139、195，由CNAS组织方提供。样品为混合菌冻干粉末，采用西林瓶真空密闭包装。

2.1.2 培养基和试剂

缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、HE琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、平板计数琼脂(PCA)、氧化酶试纸等：购自北京路桥技术有限公司，均在有效期内;API 20E试剂条：批号1001118400，用编号为CMCC50115的沙门氏菌标准株验证结果相符，法国生物梅里埃生产;沙门氏菌属多价诊断血清(A－F群)：批号20111020，无污染，用沙门氏菌标准株验证结果相符，宁波天润生产;沙门氏菌诊断血清：共59种，批号20111124，无污染，用沙门氏菌标准株验证结果相符，兰州生物制品研究所生产。

2.1.3 主要仪器设备

生物梅里埃微生物分析系统，二级生物安全柜，恒温培养箱，生物显微镜，恒温水浴锅，涡旋振荡器。

2.2 方法［3］［4］

2.2.1 样品处理

按照组织方提供的《参试指导书》，以无菌操作将样品用灭菌的生理盐水进行再水化(即溶解)定容至25mL，此液体即为测试样品(原液)，测试前充分混匀样品。

2.2.2 增菌

2.2.2.1 前增菌

将原液加入盛有225mL带玻璃珠(直径3－4mm，约50粒)的无菌BPW的三角瓶中，充分振荡混匀，放入36±1℃培养箱中进行培养18h，前增菌培养情况见表1。

表1 前增菌培养情况

2.2.2.2 选择性增菌

轻轻摇动培养过的前增菌液，分别无菌移取1mL，转种于10mL TTB增菌液和10mL SC增菌液进行培养，选择性增菌培养情况见表2。

表2 选择性增菌培养情况

2.2.3 分离培养

将2.2.2.2培养结束的增菌液分别摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环挑取增菌液各一环，分别划线接种于一个HE琼脂平板和一个XLD琼脂平板进行培养，培养结束后观察各个平板上有无生长典型或可疑沙门氏菌属的菌落。

2.2.4 生化试验

将2.2.3得到的可疑沙门氏菌属分别纯化至平板计数琼脂(PCA)上，然后进行氧化酶试验和API 20E生化试验。

2.2.5 血清学凝集试验

将生化试验结果符合沙门氏菌属特性的菌株做血清学凝集试验。采用玻片凝集法，在洁净玻片上滴加一滴A－F群多价O血清，用接种针挑取对应三糖铁琼脂斜面上的可疑沙门氏菌属菌落，与多价血清混合均匀，30s内观察凝集反应，同时用生理盐水做对照;接着用各群O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11对被检菌逐一进行凝集试验检查，再用阳性反应群所包含的各个O因子血清确定其O抗原组成，然后再用该菌所属群的H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

3 结果

3.1 分离培养

093号样品的TTB和SC增菌液在HE琼脂平板上分离出无色半透明中间有黑心的单菌落，取其中两株典型菌落分别标注为S1、S2，在XLD上分离出黑色的单菌落，取其中两株典型菌落分别标注为S3、S4;139号样品的TTB和SC增菌液在HE琼脂平板上分离出无色半透明中间有黑心的单菌落，取其中两株典型菌落分别标注为S5、S6，在XLD上分离出黑色和黄色的单菌落，取其中两株典型菌落分别标注为S7、S8;195号样品的TTB和SC增菌液在HE琼脂平板和XLD上均没有分离到典型或可疑沙门菌落。

3.2 生化试验

将分离到得可疑沙门氏菌 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分别接种至平板计数琼脂(PCA)进行纯培养，做API 20E生化试验，结果见表3。

表3 API 20E生化试验结果

根据上述API 20E生化试验结果可以看出，S1、S2、S3、S4 为同一株菌，生化谱均为0736000，S5、S6、S7、S8为另一株菌，生化谱均为4504552。上述2株菌分别利用API 20E V4.1软件查询鉴定结果，结果分别见图1和图2。S1、S2、S3、S4为奇异变形杆菌，%id=99.9%，T=1.0(图1);S5、S6、S7、S8 为沙门氏菌属，%id=96.6%，T=0.94(图 2)。

图1 菌株S1、S2、S3、S4鉴定结果

图2 菌株S5、S6、S7、S8鉴定结果

3.3 氧化酶试验

挑取平板计数琼脂平板上纯化后的菌落进行氧化酶试验，菌株 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8 的结果均为阴性。

3.4 血清学试验

为了确定分离到的沙门氏菌属的菌型，取其中一株S5做了血清学试验。利用玻片凝集法，菌株S5与A－F多价O血清发生凝集反应，而生理盐水对照不发生凝集。通过O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11逐一对菌株 S5 做凝集试验，结果发现菌株S5与O9单因子血清发生凝集。参考GB 4789.4－2010常见沙门氏菌抗原表，估计该菌株可能属于沙门氏菌D群。再用D群的H因子血清结合8种多价H血清检查第1相和第2相的H抗原，结果筛查出菌株S5的抗原模式为1，9，12：g，m：［1，7］，确定菌株 S5 为肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)。

3.5 判定

综合上述鉴定结果，判定样品093、195沙门氏菌未检出;样品139沙门氏菌检出，菌型为肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)，与收到CNAS的报告结果相符，结果为满意。

4 讨论

(1)由于参试样品为冻干粉，所以收到样品后应放置冰箱4℃中保存并尽快进行检测。

(2)由于组织方在样品发送前掺杂了多种干扰菌，为了不使目标菌漏检，检测过程尽量在无菌环境中无菌操作，防止污染菌进入样品。同时还要防止操作人员被感染，试验过程要注意生物安全。

(3)先用缓冲蛋白胨水(BPW)对样品进行前增菌十分必要，若直接进行选择性增菌，很可能使受损待测菌株的生物学特性不能得到完全恢复，容易造成假阴性结果。尽量采用多种选择性平板和同时使用各种选择性增菌液，同一种选择性平板划线分离时尽量多划，避免某些平板划线分离效果不好影响单菌落的分离，培养结束后要仔细观察可疑菌落的特征。

(4)在选择性平板培养基上，有很多菌落与沙门氏菌相似，特别是奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌等由于产硫化氢，可在HE琼脂上形成中心黑色、边缘光滑整齐的菌落，与沙门氏菌极为相似［5］。

(5)生化鉴定时尽量选择品质好的试剂，对生物学特性较为稳定的肠杆菌科属菌株进行鉴定时，不仅操作简便，而且结果准确性也比较高。

(6)关键的诊断试剂，如血清、生化鉴定试剂应先做质控，即用标准菌株做证实试验，确定无质量问题后再使用。

［1］盘宝进，黄利平.熟制加工食品－鹅肝中沙门氏菌分离与鉴定［J］.现代食品科技，2006，22(2)：223 －224.

［2］王章云.肠炎沙门氏菌引起的食物中毒细菌学调查［J］.中国人兽共患病杂志，1999，15(3)：115.

［3］GB 4789.4－2010食品卫生微生物学检验：沙门氏菌检验［S］.

［4］SN0172－92出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法［S］.

［5］赵贵明.食品微生物实验室工作指南［M］.北京：中国标准出版社，2005：141 －142.