戊二醛遗传毒性研究

许崇辉 潘芳 温巧玲 刘慧智 程树军 李妙珍

(广东出入境检验检疫局 广东广州 510623)

1 前言

戊二醛是一种具有挥发性和刺激性的化学试剂，主要用于皮革鞣制和作为杀菌剂［1］。在其生产使用过程中，可经皮肤(粘膜)、经呼吸道和经口3个途径进入人体而造成机体危害。急性毒性实验表明［2］，戊二醛小鼠经口 LD50为 248 mg/kgbw，大鼠经口LD50为239 mg/kgbw，经皮 LD50≥2000mg/kgbw，急性吸入毒性4h－LC50为768mg/m3，按急性毒性分级标准属于中低毒性物质。在现实生产和使用过程中，戊二醛的生产者和使用者暴露接触的特点是：暴露接触浓度不高，急性中毒风险较小，但进入机体的途径多、暴露接触时间长而可能存在化学物质的遗传毒性损害。

为了了解戊二醛对生产者和使用者遗传毒性的危害程度，本研究对某品牌25%戊二醛溶液进行了Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验的遗传毒性试验。现将实验检测情况报告如下。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株、动物

菌株及S9：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 和 S9，由广州市疾控中心提供;

实验动物：SPF级昆明种小鼠，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物生产许可证编号：SCXK(粤)2008－0002;微核试验、小鼠精子畸形试验动物合格证号：NO.0064739。试验前在动物房适应5d。

实验环境：SPF级动物房。实验动物使用许可证编号：SYXK(粤)2008－0086。实验期间，室温21±2℃，相对湿度52% －65%。

2.1.2 仪器

低温高速离心机，低温冰箱，恒温培养箱，洁净工作台，生物显微镜，电子天平，解培器械等。

2.1.3 主要试剂

试验样品：市售戊二醛溶液(汕头市西陇化工厂有限公司生产，浓度为25%，分析纯);丝裂霉素、1.8－二羟蒽醌：武汉驰飞精细化学科技发展有限公司;2－氨基芴：上海金穗生物科技有限公司;叠氮钠：上海天齐生物科技有限公司;地可松(Deon4－dimethylaminobenzenediazosulfonic*acid sodium：苏州亚科化学试剂股份有限公司;环磷酰胺：山西普德药业有限公司;Wright－Giemsa染液：珠海贝索生物技术有限公司产品。

2.2 方法

2.2.1 试验溶液配制

Ames试验：在无菌操作条件下，试验样品用蒸馏水稀释配制成戊二醛含量为20mg/mL溶液作为最高剂量组(即2000μg/皿)，其他剂量组分别以此为母液进行稀释;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验的高剂量组分别为125mg/kgbw(约相当于1/2的经口LD50的剂量)和83mg/kg体重(约相当于1/3的经口LD50的剂量)。其他剂量组分别用高剂量组稀释而成。

2.2.2 Ames试验［3］

采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 四株试验菌株进行试验。设2000、400、80、16μg/皿 4 个剂量组和阴性对照组、阳性对照组。采用平板掺入法，加S9与不加S9进行试验，菌株性状及S9活性经鉴定符合要求。37℃培养48h，计数每皿菌落数，如受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量－反应关系者定为阳性。整个实验在相同试验条件下进行2次独立试验。

2.2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验［4］

取体重25－30 g SPF级昆明种小鼠50只，随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、阴性对照组和阳性对照组，每组10只，雌雄各半。用蒸馏水作为阴性对照组受试物;阳性对照组给予环磷酰胺，剂量为40mg/kgbw。试验组高、中、低3个剂量组的剂量分别为125、50、5mg/kgbw;采用30h给受试物法，经口灌胃方式 2次，染毒间隔 24h，每次按0.2mL/10g体重的量给予。在第2次染毒后6h，处死各组动物。每个小鼠取2根股骨，用小牛血清常规涂片，晾干后，在无水甲醇液中固定8min，第2天在Wright－Giemsa染液中染4min。在油镜下阅片，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)，计算微核发生率;计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例(PCE/NCE)。

2.2.4 小鼠精子畸形试验［5］

SPF级昆明种雄性小鼠30只，体重25－30g，随机分为5组，每组6只。阳性对照组给予50mg/kgbw剂量的环磷酰胺;阴性对照组给予蒸馏水。3个试验组给样剂量分别为83、13、1.3mg/kgbw。按每只每天0.2mL/10g体重的量经口给予，连续5 d，各组动物正常饲养30 d。在首次灌胃后的第35天处死动物。取出二侧副睾，放入有适量(约0.5mL)生理盐水的小烧杯中。用眼科剪将副睾纵向剪1－2刀，静止约4 min，轻轻摇动。吸液涂片。空气干燥后，用甲醇固定约7 min，干燥，用1.5%伊红染色1 h，用水轻冲，干燥。每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率。

3 实验结果

3.1 Ames试验

在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，见回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。对 TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，加与不加S9，样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量—反应关系。2次独立试验的结果见表1、表2。

表1 第1次鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验结果()

表1 第1次鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验结果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受试物组 2000 124.32.1 120.33.2 37.01.0 34.01.0 128.0组别 剂 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S93.6 129.04.4 260.32.5 260.32.5400 119.73.1 125.75.5 35.72.1 37.02.6 127.73.5 128.02.0 256.32.5 256.32.580 122.33.1 126.02.0 37.04.6 32.32.3 126.72.1 127.34.9 261.03.0 261.03.0

(续表)

表2 第2次鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验结果()

表2 第2次鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验结果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受试物组 2000 124.72.4 124.62.6 37.02.1 37.03.8 128.3组别 剂 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S92.5 125.35.9 258.03.8 256.33.3400 126.74.7 127.35.4 36.32.5 35.42.6 126.74.3 128.33.8 263.03.4 25.33.880 129.72.5 124.02.3 36.72.3 35.32.8 128.92.6 128.03.5 25842.5 258.03.516 122.32.6 124.34.3 36.43.2 36.32.3 126.32.7 126.33.2 260.4.6 257.35.2阴性对照 － 128.33.9 126.32.5 34.42.3 34.32.8 127.02.6 134.83.2 2787.6 263.03.3阳性对照 见注 1238164 1296306 2349363 1363216 1497228 1793301 1260156 1257156

3.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

一般症状：灌胃约30min后，高剂量组受试动物出现以下中毒症状：呆滞、运动失调、竖毛、皮肤略紫绀、肢体瘫软、呼吸困难等，但至处死动物前，各组动物未见死亡。

镜检：在高剂量组镜检可见细胞溶解、破裂现象;样品各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，而各剂量组和阴性对照组微核率显著低于环磷酰胺组(P＜0.01)，各组PCE/NCE比值均在正常范围内，见表3。

表3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率和PCE/NCE比值

3.3 小鼠精子畸形试验

一般症状：在给予受试物期间，高剂量组和阳性对照组受试动物可见以下中毒症状：呆滞、运动失调、竖毛、皮肤略紫绀、肢体瘫软等症状，停止染毒后1－2d逐渐恢复。在实验的第35天处死动物前，各组动物均未见死亡和中毒症状，生长发育状况和体重无明显区别。

精子镜检：阳性对照组畸变率明显高于阴性对照组和高、中、低剂量组，存在倍量差异，并且差异有统计学意义(p＜0.01);受试物高、中、低剂量组畸变率分别与阴性对照组相比无显著性差异，差异无统计学意义(p＞0.05);见表4。

表4 对小鼠精子畸形发生率的影响

4 讨论

Ames试验、微核试验、精子畸形试验是经典、常用的检测化学物质遗传毒性的方法组合［6］。Ames试验是应用最广的基因突变检测方法，鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98检测移码突变、TA100、TA102菌株检测碱基置换和移码突变，反映基因水平上的遗传物质受损情况。微核试验、精子畸形试验反映了体细胞染色体遗传物质受损情况和生殖细胞受损情况。以上3项试验联合检测，可从体内、体外试验两方面，全面检测外来物质对原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞的遗传毒性。分别反映了受检化学物质对基因、染色体和生殖细胞的致突变性。

在本实验中，戊二醛作为一种具有挥发性和刺激性的化学试剂，在其生产使用过程中可多途径、低剂量进入人体，Ames试验、微核试验、精子畸形试验的最高剂量分别是 2000μg/皿、125mg/kg体重、83mg/kg体重，可见到抑菌现象或中毒症状，说明3个实验的高剂量组的染毒剂量足够大。而在此较高剂量水平下，Ames试验、微核试验、精子畸形试验的高、中、低剂量组结果均为阴性，说明戊二醛没有遗传毒性。

［1］李临生，张京东，张昌辉.戊二醛消毒剂的特点与应用［J］.日用化学工业，2004，34(6)：385－389.

［2］许崇辉，潘芳，温巧玲，等.戊二醛急性毒性研究［J］.检验检疫学刊，2012，22(4)：22 －24.

［3］GB/T 21786－2008化学品 细菌回复突变试验方法［S］.

［4］GB/T 21773－2008化学品体内哺乳动物红细胞微核试验方法［S］.

［5］GB15193.7－2003小鼠精子畸形试验［S］.

［6］FDA.Guidance for industy and review staff：Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results［S］.2006.