气相色谱串联质谱法测定禽肉中二氯二甲吡啶酚残留

陈 迪 朱 坚 樊 祥 于瑞祥 邓晓军 韩 丽 郭德华 伊雄海 黄 帆 张 欣

(1.上海出入境检验检疫局 上海 200135;2.上海海洋大学食品学院)

1 前言

二氯二甲吡啶酚是一种预防鸡球虫病的饲料药物添加剂，在国内养鸡业中被广泛应用，长期使用或不按规定用药会造成二氯二甲吡啶酚在动物体内和组织中残留。近年来药物残留一直是动物及动物源产品国际贸易中令人关注的焦点之一，欧盟以及美国、日本、中国都已规定并不断修订各种动物组织中二氯二甲吡啶酚残留的最高限量标准。美国、加拿大、日本和中国均规定禽肉组织中二氯二甲吡啶酚残留限量为5 μg/kg，禽肝脏中二氯二甲吡啶酚残留限量为15 μg/kg。

国内外关于二氯二甲吡啶酚残留量的分析报道不多，主要有气相色谱法［1，2］、液相色谱法［3，4］和色谱－质谱法［5，6］。气相色谱法一般通过酸酐酯化将二氯二甲吡啶酚分子中的极性羟基去衍生化后形成易于汽化的酯类衍生物，再采用电子捕获检测器检测，但检测时干扰多;液相色谱法一般需经两次固相萃取净化，前处理步骤繁多，灵敏度达不到现行限量要求，选择性也较差。因此开发一种能简单、灵敏、可靠的检测二氯二甲吡啶酚的方法具有重要的意义。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

鸡肉和鸡肝均购于超市。

2.1.2 仪器

气相色谱串联质谱仪：Agilent7890/7000;组织搅拌机：瑞士Kinematica公司;涡旋混合器：韩国VisionScientific Co.Lt;高速离心机：日本Hitachi公司;旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司;氮气浓缩仪：美国Zy-mark 公司;天平：0.1 mg 和 0.01 g;玻璃层析柱：20 mm i.d.×200 mm;梨形瓶：250 mL;Milli－ Q 高纯水发生器：美国Millipore公司。

2.1.3 试剂

甲醇：色谱纯，德国Merck公司;正己烷：分析纯，美国 J.T.Baker公司;丙酸酐：纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司;吡啶：分析纯，国药集团化学试剂有限公司;四硼酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司;中性氧化铝：分析纯，国药集团化学试剂有限公司;蒸馏水。

二氯二甲吡啶酚标准品：购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥98%。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液配制

准确称取适量的标准物质，以甲醇配成0.10 mg/mL的标准储备溶液，于4℃冰箱内避光保存。

移取1.00 mL标准储备溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容后即成1.0 μg/mL的标准工作液，于4℃冰箱内避光保存。

2.2.2 前处理

称取5 g试样 (精确到0.01 g)于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇，均质2 min;以4000 r/min速率离心10 min。

用移液管移取20 mL上清液于氧化铝柱中，当液面与氧化铝上表面相切时加入10 mL甲醇淋洗，弃去流出液;然后用45 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于250 mL梨形瓶中;50℃水浴旋转蒸干;用2 mL甲醇溶解残渣，转入15 mL带螺旋盖离心管，并用1 mL甲醇洗涤梨形瓶，合并;用氮气流吹至大约0.5 mL。

在上述试管中依次准确加入4 mL0.1 mol/L四硼酸钠溶液，0.50 mL 正己烷，25μL 吡啶和 50 μL丙酸酐;加塞，涡旋混合1 min，4500 r/min离心5 min;将上层正己烷移入进样小瓶中，供气相色谱串联质谱分析。

2.2.3 色谱条件

色谱柱：毛细管柱DB－5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm);升温程序：初始温度 50 ℃保持 1 min，以20℃/min升高到250℃后保持5 min;进样口温度：260 ℃;流速：1.0 mL/min;载气：氦气，纯度≥99.999%;进样模式：不分流进样，1 min后开阀;进样量：1 μL。

2.2.4 质谱参数

接口温度：280℃;离子源：电子轰击源 (EI);碰撞能量：15 eV;离子源温度：230℃;检测方式：MRM;离子对(m/z)：191/128，191/156。

3 结果与讨论

3.1 提取方法的优化

对于样品的提取，原来标准采用振荡抽滤的方法，要加入助滤剂改善过滤速度。本方法采用均质后以4000 r/min离心10 min后移取部分上清液进行后续净化操作，使过程简化。试验结果显示，采用此方法可使提取更完全，提取率更高且更稳定。离心分离后，液相清澈，液固界面非常明显。另外，直接移取部分上清液进行后续净化，这样可以避免过滤后滤渣洗涤是否完全的问题，所以实验重现性较好。

为了有效地提取鸡肉组织中的二氯二甲吡啶酚残留，分别采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同有机溶剂进行提取试验。试验中发现，丙酮与甲醇的提取回收率相当，但丙酮提取液中脂肪等杂质的含量相对较高;乙酸乙酯和二氯甲烷则难以从未除去水的鸡肉组织中提取目标物，回收率低。因此，本实验最终选择甲醇作为提取溶剂。

3.2 净化方法的选择

在实验中还对市售氧化铝固相萃取(SPE)小柱的净化效果进行了试验，结果表明这些小柱都不能很好地除去脂肪等杂质。为此，采用自装填氧化铝层析柱净化提取试液，结果发现，氧化铝层为5g和10g的层析柱回收率较低，15 g和20 g的层析柱回收率高，且二者差异不明显，洗脱液也相对干净。比较分析，最终选择氧化铝层的填充质量为16 g。

3.3 质谱条件的选择

通过对二氯二甲吡啶酚丙酯全扫描后获得EI质谱图(见图1)，其特征碎片离子归属：m/z247为分子离子，m/z191为二氯二甲吡啶酚分子。选择二氯二甲吡啶酚分子m/z191作为母离子，以一定的能量碰撞后获得相应的质谱图(图2)，其特征碎片离子归属：m/z156为母离子失去一个Cl离子后的产物，m/z128为其进开环后一步失去乙烯分子后的产物。为此，选择m/z156及m/z128为子离子，与母离子形成两个子离子对，用不同的能量对二氯二甲吡啶酚进行MRM扫描后，发现碰撞能量为15 eV时，响应值最高，故以此条件采用MRM模式对二氯二甲吡啶酚进行定性和定量分析。

图1 二氯二甲吡啶酚丙酯的全扫描质谱图

图2 二氯二甲吡啶酚丙酯的子离子扫描质谱图(20 eV)

3.4 色谱条件

选择起始温度50℃，并采用每分钟20℃的升温速率时得到的峰形状较好。

3.5 线性范围

二氯二甲吡啶酚标准品浓度在20 μg/L－240 μg/L内，浓度与响应值呈线性关系，线性回归方程y=1.132x －2.553，相关系数大于0.998。

3.6 回收率、精密度和检测限(LOQ)

以不含二氯二甲吡啶酚的鸡肉和鸡肝为检测样品，采用外加法在样品中分别添加3个不同浓度水平的二氯二甲吡啶酚，作回收率和精密度试验，见表1;其标准溶液(120ng/mL)及鸡肉中 5.0 μg/kg添加水平的样品溶液图谱见图3、图4;LOQ：鸡肉中为5.0μg/kg，鸡肝中为10.0μg/kg。

表1 鸡肉中二氯二甲吡啶酚测定的回收率、精密度

图3 二氯二甲吡啶酚标准品的MRM色谱图(120ng/mL)

图4 鸡肉中添加5 μg/kg二氯二甲吡啶酚的MRM色谱图

4 结论

本方法选择适宜的前处理，优化了最佳仪器条件。结果表明，方法提取率高，检测效果灵敏且稳定，选择性好，能满足检测要求，适合禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量的测定。

［1］连锦明，黄颖，童庆松，等.气相色谱法测定动物性食品中二氯二甲吡啶酚的研究［J］.中国卫生检疫杂志，2004，14(1)：30－31.

［2］郑举，刘红云.禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量的快速检验［J］.中国兽药杂志，2000，35(3)：27－29.

［3］李水明，刘丽，刘俩燕.高效液相色谱法测定动物性食品中二氯二甲比啶酚的研究［J］.现代预防医学，2008，35(10)：1903－1906.

［4］刘红河，康莉，陈春晓，等.禽肉中二氯二甲吡啶酚的高效液相色谱法测定［J］.中国公共卫生，2005，21(3)：354 －355.

［5］张睿.气相色谱－质谱法测定禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量［J］.分析测试学报，2001，20：266 －267.

［6］刘祥国，苏贻娟，方炳虎，等.气相色谱－质谱法测定鸡肉组织中残留的氯羟吡啶［J］.色谱，2009，27(1)：86－90.