荧光定量PCR方法鉴别牛、羊奶粉

孟 芳 张卿 蔡婧怡 禹思宇 赵和平 朱忠武 唐连飞

(湖南出入境检验检疫局 湖南长沙 410004)

1 前言

荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是分子生物学中广泛运用的一种新定量试验技术，是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实施在线监控反应过程，结合相应的软件可以对参照物进行分析，计算检测样品模板的初始浓度。目前这项技术越来越多地运用到食品检测之中，例如，用荧光定量PCR技术来检测食品中的转基因成分［1］和微生物成分等［2］，其中部分荧光定量PCR检测方法已经作为标准推广于社会。但是荧光定量PCR技术在食品检测的运用过程中也受到一些限制，主要是因为各种食品经过不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破坏，并且在生产过程中，混入不同的添加剂和佐料，使食品的成分更加复杂［3，4］。如何提取出高质量的DNA成为荧光定量PCR应用于食品检测的一个限制因素。

据营养学专家介绍，羊奶在国际营养学界被称为“奶中之王”，羊奶的脂肪颗粒体积为牛奶的三分之一，更利于人体吸收，并且长期饮用不会引起发胖。羊奶中的维生素及微量元素明显高于牛奶，美国、欧洲的部分国家均把羊奶视为营养佳品，欧洲鲜羊奶的售价是牛奶的7倍。但是现在市面上羊奶原料紧张，部分商贩以牛奶掺入羊奶中以降低制造成本。本方法无需进行DNA提取，奶粉经核酸释放剂处理后可直接进行荧光定量PCR检测，并采用荧光定量PCR方法来鉴别牛、羊奶粉。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品与试剂

不同品牌牛、羊奶粉:均从超市购买;苯酚、氯仿、异戊醇等试剂:均为分析纯;核酸定量检测试剂盒(PCR－荧光探针法):由圣湘生物提供。

2.1.2 仪器

荧光定量PCR扩增仪LC480:罗氏公司;台式高速离心机Mikro200:HETTICH公司;微量分光光度计Nannodrop1000:Thermo公司。

2.2 方法

2.2.1 定量PCR反应体系

取10mg奶粉样品于2ml的Eppordorf管中，加100μL蒸馏水溶解奶粉，取10μL溶解后的液态奶，再加入10μL核酸释放剂，吹打混匀5次，等待10min。

按下列组分配制PCR反应液:PCR反应液16μL;热启动酶1μL;两套引物和探针同时加入，上下游引物各1μL;探针溶液1μL;经核酸释放剂处理过的样本5μL。

2.2.2 定量PCR反应条件

依据同源性分析结果，最终选择牛羊线粒体DNA的12SrRNA种内保守种间特异的区域作为牛羊特异检测的靶序列。依据靶序列，用Primers软件设计检测牛源成分的实时定量引物和探针及检测羊源成分实时定量引物和探针。牛源性探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团，羊源性探针5’端标记HEX荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。引物和探针由大连宝生物公司合成。引物探针序列及各种参数［10］见表1。反应条件:95℃ 10sec;95℃ 5sec，60℃30sec 40个循环。

表1 引物及探针序列

3 结果与分析

3.1 定量PCR鉴别牛羊奶粉方法的建立

在同一反应管内对牛、羊的12SrRNA同时进行扩增，应用多色荧光检测技术，对反应液中含有的两种不同荧光进行两通道同步检测，实现多色荧光同步检测。结果见下表2、图1、图2。结果表明羊奶粉中无牛奶成分，牛奶粉中也无羊奶成分。检测过程中仅需奶粉5mg，表明该方法所需样本少、无需进行DNA提取，操作过程简单省时。

表2 牛、羊奶粉荧光值及结果判定

图1 羊奶粉中牛源性成分鉴定结果

图2 牛奶粉中羊源性成分鉴定成果

3.2 定量PCR鉴别牛羊奶粉方法的应用

对从超市购买的6种不同品牌的羊奶粉进行鉴别检测。结果显示(图3)FAM通道除阳性对照外，6个羊奶粉样品均未出现扩增曲线，表明这6个羊奶粉中没有掺入牛奶成分。另外6个羊奶粉HEX通道均出现典型扩增曲线(图4)，表明其确为羊奶粉。

表3 6种品牌羊奶粉荧光PCR扩增结果

图3 6种品牌羊奶粉中牛源性成分的鉴定结果

图4 6种品牌羊奶粉中羊源性成分的鉴定

3.3 羊奶粉中荧光PCR检测牛奶粉的敏感性分析

分别称取1g羊奶粉和牛奶粉，加入10mL去离子水溶解。同时，将牛奶以不同的比例掺入纯牛奶中，提取DNA并进行荧光PCR扩增，结果如图5所示，当牛奶以 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20% 的比例(体积)掺入至羊奶中时，均能通过荧光PCR得到扩增(如图5)，且牛奶含量越高CT值越小，表明本法敏感性高。

图5 检测含不同比例牛奶的羊奶的荧光PCR结果

4 讨论

奶食品有牛奶、马奶、山羊奶等。在欧美国家羊奶被视为乳品中精品，称作“贵族奶”，国际学界誉为“奶中之王”。羊奶因其营养价值更优于牛奶，市场售价高于奶牛，加上现在市面上羊奶原料紧张，部分商贩以牛奶掺入羊奶中以降低制造成本，这严重损害了消费者的利益。

目前没有对羊奶粉成分掺假检测方法的报道，仅有个别对于牛奶成分掺假检测方法的报道:吴茹怡［5］采用化学方法检测牛奶中的豆质成分和大米淀粉成分等，但是该方法过于表观，且灵敏度不够;皮付伟等［6］采用近红外的分析方法来检测牛奶的成分，但是对牛奶中的羊源性成分检测不能判断。本实验采用荧光定量PCR方法鉴别奶粉中的牛、羊源性成分，可鉴别羊奶粉的真假。实验证明，该方法操作简单可行，能检测到羊奶中掺入的牛奶成分低至0.1%，灵敏度高。

之前的研究中运用以DNA为基础的荧光定量PCR方法检测奶粉中牛羊源性成分的关键在于DNA提取的成功与否。由于不同的奶粉具有各不相同的功能，因此其成分及加工工艺也都各不相同，各个品种之间的差异性很大，在提取DNA时要充分考虑到各类成分对DNA提取数量和质量的影响，同时也要考虑到加工工艺对 DNA的降解影响［7］。田雨［8］曾从牛乳中的白细胞中提取牛奶的DNA，但是，该方法需要的样品多，提取得到的DNA不仅浓度低，且蛋白含量过高。覃芳芳［9］将酚仿抽提DNA的方法和前处理相结合得到了一种快速简便的从牛奶中提取DNA的方法，但该方法更适用于牛奶中植物成分DNA的提取。以上方法都需要经过DNA提取的过程，费时费力且DNA质量和纯度并不高，本实验不需要经过DNA的提取过程，微量样本经核酸释放剂裂解后直接可以进行荧光定量PCR检测。该方法快速简便，且灵敏度高。另外，该方法全过程仅需1.5h左右，与其他方法相比更快速更适用于推广。本实验建立起来的牛羊奶粉的鉴定方法快速、灵敏，可利用该方法来鉴别奶粉，打假治劣、维护消费者权益。

［1］蔡慧农，刘光明，苏文金，等.TaqMan探针用于转基因食品的荧光定量 PCR检测［J］.食品与发酵工程，2008，29(12):1－6.

［2］马兆飞，李洁莉，胡红琴，等.PCR和实时PCR技术快速检测牛奶样品中的沙门氏茵［J］.中国食品学报，2008，8(5):132－137.

［3］邵碧英，张体银，杨婕，等.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化［J］.中国兽医科技，2005，35(3):225－229.

［4］陈沁，徐仙，姚丽萍.牛奶掺豆浆和奶粉的PCR检测［J］.生物技术通报，2010，5.162 －165.

［5］吴茹怡.牛奶掺假物检验方法研究［J］.大众科技，2005(9):91－92.

［6］皮付伟，王燕岭，鲁超，等.CCD短波近红外光谱仪测定牛奶成分的可行性研究［J］.现代科学仪器，2006(4):34，36.

［7］邵碧英，杨婕，张体银.动物产品的DNA提取方法［J］.畜牧与兽医，2005，37(9):47 －49.

［8］田雨.从牛奶中分离DNA方法的建立［J］.乳业科学与技术，2006，3:112 －113.

［9］覃芳芳，邓鸿铃，郭新东，等.牛奶中植物成分的PCR检测方法研究［J］.食品科学，2008，29(6):234－236.

［10］郑文文.饲料中牛羊源成分荧光定量PCR检测方法的建立［D］.吉林:吉林大学硕士学位论文，2009，6:13.