超高效液相色谱－串联质谱法测定猪肉和猪尿中的苯乙醇胺A

卢艳芬

(长沙市畜禽水产品质量检测中心 湖南长沙 410013)

1 前言

苯乙醇胺A又称为克仑巴胺，化学名称为2－4－(4－硝基苯基)丁基－2－基氨基－1－甲氧基苯乙醇，是一种人工合成的化学物质。苯乙醇胺A是福莫特罗的同分异构体，是美国礼来公司合成莱克多巴胺时产生的副产物，具有同克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等药物相同的作用和效果，属于β－受体激动剂。苯乙醇胺A同样具有营养再分配作用［1］，可以用于刺激动物生长，加强蛋白质在动物体内沉积，提高基础代谢水平，使体脂趋于分解，促进生猪长速加快，提高瘦肉率［2］。而人吃了含这种药物的猪肉后，可出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别是对心脏病、高血压患者危害更大［3］。2010年12月农业部公告禁止在饲料和动物饮用水中添加该物质［4］。

目前，关于动物源性食品中β2－受体激动剂类药物残留检测的报道较多［5－8］，但关于苯乙醇胺A在动物源性食品及动物尿液中检测方法的研究非常少［9，10］。孙志文等利用酶解16h后反萃再过SPE小柱的处理方法，经液相色谱－串联质谱仪检测猪肌肉中的苯乙醇胺A［11］。本文对猪尿和猪肉中苯乙醇胺A的酶解、固相萃取等提取方法和色谱质谱测定进行了系列研究，设计出了快速、准确、灵敏度高的苯乙醇胺A超高效液相色谱串联质谱测定法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

UPLC－MS/MS：waters公司TQD系列;离心机：湘仪H－1650型;固相萃取装置：Alltech;pH计：雷磁PHSJ－4A型;涡旋混匀器：德国IKA，MS3型;振荡器：苏州威尔 SHA－C型;超声仪：昆山 KQ－500DE型;氮气吹干仪：美国N－EVAPTM112型;固相萃取柱：waters公司MCX，60mg/3mL。

2.1.2 试剂

苯乙醇胺A标准品 (多伦多化学研究公司);甲醇(色谱纯，Merck);高氯酸(分析纯);β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(Merck);乙酸铵(色谱纯，TEDIA);甲酸(色谱纯);氨水(分析纯);乙酸(分析纯);盐酸(分析纯)。

2.2 方法

2.2.1 液相色谱参考条件

色谱柱：BEH C18(50*2.1mm，1.7μm);流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇溶液;梯度洗脱：0 －3.4min 维持 95.0%A，3.4 －3.6min 为95%A 变化至72%A，3.6 －5.5min 维持72%A，5.5－5.7min为72%A 变化至 30%A，5.7 －6.7min维持30%A，6.7－8min为30%A变化至95%A。流速：0.3mL/min;柱温：35℃;进样量：4μL。

2.2.2 质谱参考条件

电喷雾离子源;正离子扫描;多反应检测;电离电压：3.0kV;源温：120℃;雾化温度：350℃;锥孔气流速：50L/h;雾化气流速：580L/h。苯乙醇胺A的检测条件如表1。

表1 苯乙醇胺A最优化的质谱参数

2.2.3 样品前处理

2.2.3.1 猪肉样品

酶解：准确称取2g样品于50mL离心管里，加入0.2mol/L 乙酸铵缓冲溶液(pH=5.2)8.0mL，加入β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，涡旋混匀，于52℃下避光水浴震荡反应2 h。提取：酶解后放置至室温，用高氯酸调pH至1，涡旋混匀，于80℃水浴中超声30min，11000r/min高速离心10min，倾出上清液于另一50mL离心管里，加入0.1mol/L高氯酸溶液4mL于残渣中，涡旋并超声10min后11000r/min高速离心10min。合并上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4，待用。

净化：MCX小柱依次用3mL甲醇，3mL水活化，取备用液的1/2过柱，再依次用3mL 0.1mol/L高氯酸溶液，3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL 5%氨化甲醇洗脱。洗脱液在40℃下用氮气吹干，用甲醇+0.1%甲酸溶液(5+95)1mL溶解，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，供液质联用仪用。

2.2.3.2 猪尿样品

准确移取2mL尿样于50mL离心管中，加入2mol/L 乙酸铵溶液(pH=5.2)200μL，用乙酸调pH至5.2，加入40μLβ － 盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，52℃下水浴振荡器中反应2h。反应完成后11000r/min离心10min，取上清液全部过MCX固相萃取小柱。MCX柱依次用3mL甲醇、3 mL水对柱子进行活化，依次用3mL 2%甲酸溶液、3mL甲醇淋洗，用3mL 5%氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，在45℃下氮气吹干，加入甲醇+0.1%的甲酸溶液 (5+95)2mL溶解残渣，过0.22μm滤膜后待测。

3 结果与讨论

3.1 前处理条件的优化

β－兴奋剂依据其结构可分为苯胺型(典型化合物如克伦特罗)和苯酚型(典型化合物如莱克多巴胺)两大类。苯乙醇胺A属于苯酚型结构，为中等极性的疏水性化合物，易溶于酸性溶液、碱性溶液、甲醇、乙酸乙酯等极性溶剂。因此，设计残留分析时，多以酸性混合有机溶剂为提取液进行提取。

苯酚型激动剂在动物机体的代谢以轭合态存在，故其残留检测必须要经过水解过程。通常的水解方法有酸解［12，13］、碱解［14］和酶解［15，16］等，而对于猪肉和猪尿，通常采用酸解和酶解两种方法。考虑到酸解成本低，反应后的杂质少等特点，我们在设计提取方案时，首先考虑的是酸解提取。考察了不同的酸解浓度(0.2、0.5、1、2mol/L 等 )和不同酸解温度(60、80℃)下的提取条件。结果发现：对于苯酚型的受体激动剂如沙丁胺醇、莱克多巴胺等，由于其高轭合率，酸解不能将其全部游离出来，致使目标化合物回收率低，无法满足检测要求。因此，改用酶解方法进行提取。在现有的文献资料中，β－兴奋剂的酶解一般都需要反应12－16h［17］。这样长时间的酶解不适用于实际工作中的快速监测。为此，本文对β－兴奋剂类化合物的酶解条件进行了研究，以期找到合适的酶解条件。苯乙醇胺A与沙丁胺醇和莱克多巴胺都属于苯酚型。由于实际工作中没有苯乙醇胺A的阳性样品，故以沙丁胺醇阳性猪尿为考察对象，研究了52℃下猪尿中沙丁胺醇的酶解时间(1－16h)与酶解效率的关系，以及与传统37℃16h酶解方法的比较。结果见表2。从表2中可以看出，在52℃下 ，酶解2h时，猪尿中沙丁胺醇的酶解浓度已经达到了峰值，且与37℃16h酶解条件下的峰面积值相当。在改变酶解温度的同时，还增加了高氯酸沉降蛋白、80℃高温灭活及超声提取等步骤，以进一步提高回收率。

表2 不同酶解条件下猪尿中的沙丁胺醇峰面积

3.2 色谱质谱条件的优化

根据苯乙醇胺A的化学结构及性质，选取BEH C18(50*2.1mm，1.7μm)色谱柱进行分析。此外，在流动相中加入适量的甲酸以增加其检测的灵敏度，在合适的条件下，苯乙醇胺A在6.12 min左右出峰，总运行时间为8min，保证了在样品中杂质组分与目标化合物的有效分离，从而减少了基质的干扰和抑制作用。此外，为增加测试的准确度，本实验采用空白基质加标准品的方法来做标准工作曲线。

为获得较高灵敏度的检测结果和消除基质对目标物质的抑制作用，在本实验中采用空白基质加苯乙醇胺A标准溶液进行调谐，选取最优的毛细管电压、碰撞能等参数，其结果见表1。苯乙醇胺A的二级质谱图和提取离子多反应监测图见图1和图2。

图1 苯乙醇胺A的二级质谱图

图2 苯乙醇胺A的多反应监测色谱图

3.3 方法的线性关系和测定限

3.3.1 方法的线性关系

用甲醇+0.1%甲酸水(5+95)配制系列浓度标准工作溶液：0.2、1、2、5、10、20、50μg/L。在确定的实验条件下进样分析，制作标准工作曲线，其结果见图3。从图中可以看出在0.2μg/L －50μg/L的浓度范围内，苯乙醇胺A相关系数大于0.9999，线性范围宽，线性相关性好。

图3 苯乙醇胺A的标准工作曲线

3.3.2 方法的灵敏度

本方法条件下，测得苯乙醇胺 A的检测限(LOD，S/N=3)和定量限 (LOQ，S/N=10)分别为0.2μg/kg、0.5μg/kg(猪肉)和 0.2μg/L、5μg/L(猪尿)。多反应监测图见图4和图5。

图4 空白猪肉样品添加苯乙醇胺A的多反应监测色谱图(0.2μg/kg、0.5μg/kg)

图5 空白猪尿样品添加苯乙醇胺A的多反应监测色谱图(0.2μg/L、0.5μg/L)

3.4 方法的回收率和精密度

对空白猪肉和猪尿样品进行了3个浓度的添加回收实验：0.5、1、2μg/kg 和 0.5、1、2μg/L。每个浓度做6次平行测定，苯乙醇胺A测定的回收率和精密度结果见表3。

表3 回收率与精密度实验结果(n=6)

猪肉样品的回收率为79.0% －103%，相对标准偏差为4.1% －12.5%;猪尿样品的回收率为80.3% －102%，相对标准偏差为：5.9% －13.7%。

4 方法的协同实验

本方法在我中心实验室制定完成后，与湖南省出入境检验局检验检疫技术中心、长沙市食品质量安全监督检测中心对其进行了协同验证实验。猪尿和猪肉各3个添加浓度、每个浓度进行6次平行测定。协同实验结果：猪肉中0.5、1、2μg/kg 添加回收率在71.0% －107%之间，变异系数在2.1% －15.1%之间;猪尿中 0.5、1、2μg/L 添加回收率在76% －105%之间，变异系数在2.46% －11.93%之间。

5 结论

本研究建立了猪肉和猪尿中苯乙醇胺A残留的UPLC－MS/MS快速定性和定量方法，将酶解时间从现有各标准中的12－16h缩短到2h，大大节约了分析时间;样品处理方法简单，有机溶剂消耗少，节约了分析成本。方法精密度和准确度高，实用性强，适用于生猪屠宰前后猪尿和猪肉中苯乙醇胺A残留监控。

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