89 Sr照射对乳腺癌MCF-7细胞分泌sFas、sFasL 的影响

任 凭，李焕斌，张 琦，王 玲，文正伟，谢克俭

(1温州医科大学生物技术中心，浙江温州325027;2温州医科大学核医学教研室;3温州医科大学检验学院放射免疫中心)

89Sr是一种趋骨放射性核素，是治疗肿瘤骨转移的有效手段之一。目前，可溶性细胞凋亡相关蛋白sFas在肿瘤发生、发展中的作用已引起临床研究者的广泛关注，Fas系统与乳腺癌关系的研究多局限在乳腺癌组织中的Fas/FasL表达，但鲜有89Sr照射对乳腺癌MCF-7细胞中sFas、sFasL影响的报道。2012年1月～2013年6月，本研究检测了sFas在乳腺癌细胞中的表达及其在不同浓度89Sr照射后的变化，旨在探讨89Sr诱导乳腺癌细胞凋亡的生理机制，为乳腺癌骨转移患者内照射的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人高转移性乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海细胞库。含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(杭州四季青公司)。放射性核素89Sr由宁波君安药业公司提供，pH 8.0，放化纯度 ＞98%，放射性比活度为3.7×107Bq/mL。ELX800G型酶标仪(奥地利Dialab公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 选择MCF-7细胞1×105/mL接种于48孔细胞培养板中，每孔100μL;分别加入终浓度为 0.001、0.01、0.1、1、10 μCi/mL 的89Sr注射液中，不同浓度的89Sr注射液各设3个复孔，同时设对照孔。每孔加入RPMI-1640全培养液1 mL，置37℃、5%CO2中培养，培养24 h后收集细胞上清培养液，用于sFas、sFasL检测。终止培养后，培养板行水平离心，取细胞培养上清液备检sFas、sFasL。

1.2.2 sFas、sFasL检测 取50μL细胞上清液于相应的反应板孔中，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验、ELX800G型酶标仪检测sFas、sFasL，试剂盒由深圳晶美生物公司提供，严格按说明书操作，所有检测批内CV、批间CV均达要求范围。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

乳腺癌MCF-7细胞经不同浓度89Sr照射后，随着89Sr浓度升高，sFas、sFasL水平逐渐降低(P均＜0.05)。不同浓度89Sr照射对乳腺癌MCF-7细胞中sFas、sFasL的影响见表1。

表1 不同浓度89Sr照射对乳腺癌MCF-7细胞中sFas、sFasL 的影响(pg/mL，¯x ±s)

3 讨论

凋亡是一种程序性细胞主动自杀过程，凋亡活动异常将导致各种疾病。多数研究表明，多种肿瘤组织及细胞存在Fas、sFas异常表达，尤以sFas表达升高较明显，且与多种肿瘤的发生、发展有关［1～4］。Fas是细胞表面诱导凋亡的分子，表达于激活的淋巴细胞、病毒感染细胞、肿瘤细胞及某些组织等。FasL是Fas的天然配体，激活的淋巴细胞、病毒感染细胞、肿瘤细胞等通过其表面的FasL与另一细胞上的Fas结合，使另一细胞死亡，这就是Fas介导的凋亡。sFas是一种因Fas基因在转录过程中mRNA剪切方式改变、编码合成跨膜区不完整或缺失的可溶性Fas，其可竞争Fas与FasL结合，从而抑制细胞凋亡。在Fas和FasL系统中，可溶性Fas和FasL对介导细胞凋亡起主要调节作用［5］。Sheen-Chen 等［6］研究发现，在凋亡调控中，sFas作为抑制剂参与Fas调控细胞凋亡。

Liu等［7］研究发现，体外培养的前列腺癌细胞可分泌大量sFasL。苏逢锡等［8］采用抗FasL抗体免疫印迹法在MCF-7细胞培养上清液中检测出可溶性FasL。本研究发现，乳腺癌 MCF-7细胞中的sFas、sFasL水平均明显高于正常乳腺细胞。细胞培养上清液中的sFas、sFasL来源于MCF-7细胞，是跨膜型Fas、FasL蛋白的膜外段脱落产物。MCF-7细胞经89Sr照射诱导后，在射线持续作用下肿瘤细胞凋亡。细胞上清液中的sFas、FasL水平随着89Sr浓度增加而逐渐下降，说明89Sr照射的β射线诱导了乳腺癌细胞凋亡。经不同浓度89Sr照射24 h后细胞培养液中的sFas、sFasL变化规律提示，sFas参与了乳腺癌的发生、发展及治疗转归的病理生理过程。因此，凋亡调控因子与乳腺癌发生、发展有密切关系，可作为乳腺癌诊断和预后评估的指标。乳腺癌患者血清sFas异常表达可能源于肿瘤细胞sFas RNA表达增加，但究竟何种因素引发此改变尚不明确。目前，有研究认为sFas竞争性阻断细胞膜上的Fas与FasL结合，导致乳腺癌细胞凋亡受阻，从而抑制凋亡发生，促使肿瘤转移病灶细胞数目增加，范围扩大;另外，sFas作为细胞膜上Fas的脱落部分，降低了细胞膜上的Fas密度，也减少了Fas介导的细胞凋亡，故可加重乳腺癌转移发生。由此可见，通过诱导凋亡或对抗凋亡抑制可达到治疗肿瘤的目的，凋亡调控因子有望成为肿瘤治疗新的靶目标。本研究还表明，临床上乳腺癌骨转移患者行89Sr治疗后，如检测其血清sFas、sFasL水平，可评价89Sr治疗乳腺癌骨转移的疗效。

凋亡调控因子与乳腺癌的发生、发展有密切关系，通过诱导凋亡或对抗凋亡抑制可达到治疗肿瘤的目的。89Sr作为一种趋骨放射性核素，是治疗肿瘤骨转移的有效手段之一［9～11］，静脉注射后可高度持续浓缩到成骨转移病灶，利用其发射的β射线诱导病灶中的肿瘤细胞凋亡，促使局部骨质修复，转移病灶缩小乃至消失，而其作用对正常骨的影响极小;另外，89Sr可降低碱性磷酸酶，减轻骨质溶解，达到治疗与止痛的目的。以往文献报道，89Sr治疗肿瘤骨转移灶的有效率为70% ～80%，对乳腺癌骨转移灶骨痛最有效，其有效率为90%［12］。本研究表明，乳腺癌MCF-7细胞中的sFas变化与89Sr浓度呈负相关，说明89Sr照射的β射线诱导了乳腺癌细胞的凋亡，降低了肿瘤细胞分泌sFas的水平。但由于细胞凋亡的调节机制复杂而精细，可能还存在Bcl-2基因家族、Caspases家族、p53等调控机制和影响因素，因此，细胞凋亡在乳腺癌发生、发展和治疗转归中的确切作用尚需进一步研究。

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