乳腺癌中CD44S和CD44V6基因蛋白表达的实验研究

章 革，李 涛

（营口市妇产儿童医院1.病理科；2.生殖科，辽宁 营口115000）

细胞粘附因子为一种细胞表面跨膜糖蛋白分子，分布于诸多细胞表面，包括淋巴细胞、单核细胞、RBC，成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞及肿瘤细胞等。CD44参与淋巴细胞的激活，以及细胞间透明质酸的特异性粘附，变异性CD44基因的多样性表达与肿瘤的生长、转移、复发等肿瘤生物学行为相关。我们应用免疫组化方法对乳腺癌中CD44S和CD44V6基因蛋白产物表达与组织学分型、脉管浸润、淋巴转移、预后、复发等相关性进行实验研究。

1 材料与方法

1.1临床资料收集本院2000年1月—2010年12月间，161例原发性乳腺癌根治术后的临床病理及随访资料，最大年龄83岁，最小年龄29岁，中位56岁。病史9个月—6年，最长随访时间为7年。根据WHO（2003）乳腺癌分类及分级标准，进行组织学分类，其中乳头状癌38例占23.6%，浸润性导管癌62例占38.5%，硬癌38例占23.6%，导管原位癌4例占2.48%，小叶原位癌8例占4.96%，其它11例占6.83%。在161例乳腺癌研究样本中，有淋巴结转移病例11例占6.8%。所有标本均由10%福尔马林固定，石蜡包埋，选自最具组织学分型代表性、最大肿瘤表面积，常规4－5μm连续切片，分别作HE染色及CD44s、CD44V6、CD34免疫组化染色。

1.2.1 主要试剂 鼠抗人CD44S单克隆抗体（DF1485）、CD44V6单克隆抗体（2F10）、CD34单克隆抗体（OBEnd／10）、SP免疫组化试剂盒均购自福州迈新公司。

1.2.2 方法 所有标本均常规切片，采用两步法免疫组化染色；石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液中120℃抗原修复，PBS代替一抗作为阴性对照。脉管浸润实验研究采用CD34单抗标记脉管内皮细胞，与H·E双重染色鉴别血管、淋巴管。

1.3判断标准CD44S200X全视野：（－）：阳性细胞数＜25%、（1＋）：阳性细胞数25%－50%、（2＋）：阳性细胞数50%－75%、（3＋）：阳性细胞数＞75%。CD44V6X200全视野：（－）：阳性细胞数＜25%、（1＋）：阳性细胞数25%－50%、（2＋）：阳性细胞数50%－75%、（3＋）：阳性细胞数＞75%。

脉管浸润：以CD34阳性表达确认脉管内皮细胞，管腔内观察到肿瘤细胞或瘤栓者为浸润阳性。（管腔内观察到RBC为血管，无RBC是淋巴管）。

1.4统计学分析采用SPSS11.5统计学软件进行处理，各组间相关性检测采用Spearman等级相关分析检验。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中，CD44S阳性表达为32.9%，CD44V6阳性表达为67.1%，CD44阳性表达，在各组织学类型之间无显著性差异（表1）。

表1 CD44基因蛋白表达与组织学分型（%）

2.2 脉管浸润病例，在各组织学分型中，依次为硬癌＞浸润性导管癌＞乳头状腺癌（表2）。

表2 脉管浸润与组织学分型

2.3 脉管浸润与淋巴结转移（P＜0.001）、远隔转移（P＜0.05）有显著相关性（表3）。

表3 脉管浸润与淋巴结转移、远隔转移

2.4 腋窝淋巴结转移灶与原发灶之间，CD44基因蛋白表达分别为：原发灶中，CD44S阳性表达73%，CD44V6阳性表达100%。腋窝淋巴结中，CD44S表达呈阴性，CD44V6阳性表达为64%（表4）。

2.5 应用CD34基因蛋白标记脉管内皮细胞，突出显现脉管形态学特征并可直观反映微血管生成状态。

表4 腋窝淋巴结转移灶与原发灶间CD44基因蛋白表达

3 讨论

CD44是一种由单一基因编码构成的一类具有高度特异性的多功能单链跨膜糖蛋白，其变构体CD44V6主要参与异质性黏附，即瘤细胞与宿主细胞及宿主基质的黏附，异质性黏附在癌细胞侵袭、转移过程中起到促进作用［1］。另有观点认为：CD44V6可能通过改变癌细胞的骨架结构和抗原位点的分布，获得淋巴细胞样免疫屏蔽，逃避机体免疫系统的识别，且更易于进入淋巴结形成转移瘤［2］。本实验研究检测161例乳腺癌标本中，CD44S阳性表达 为 32.9%，CD44V6 阳性 表 达为 67.1%，CD44V6的阳性表达明显高于CD44S。说明CD44S的表达是一个较为复杂的生物学过程，即在同一肿瘤组织中，表现出粘附因子基本型的缺失而变异体CD44V6呈高表达。由此可推论CD44V6的高表达与乳腺癌组织生长及临床进展密切相关。同时，本实验研究中还显示，CD44基因蛋白表达与乳腺癌各组织学分型之间相关性不明显。

而伴随乳腺癌病程的进展，在腋窝淋巴结转移灶中，CD44S表达缺失，CD44V6呈现高表达（64%），即原发灶中CD44S表达73%，CD44V6表达100%。提示已有转移的病例中，原发灶和转移灶中均能检测出CD44V6的高表达；提示CD44V6阳性表达与乳腺癌进展、侵袭、转移能力的增强有关［1，3］。

另外，在本研究中发现：CD44表达在肿瘤预后，复发统计中显示：CD44V6的高性表达提示肿瘤预后不良，且证实与肿瘤的转移潜能有相关性［4］。

血道和淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移形式，肿瘤血管是其供应营养的物质的主要途径，淋巴管是肿瘤细胞转移的重要途径［5］。本研究应用CD34标记脉管内皮细胞，突出显现脉管形态学特征，同时配合HE复染，准确地观察到了脉管内瘤细胞的浸润及血管、淋巴管的鉴别。观察结果显示：CD34单克隆抗体 标记，内皮细胞着色清晰，脉管形态显现明了。脉管内经Eosin复染可确切观察RBC的有无，以此鉴别血管或淋巴管。应用该方法观察发现：脉管浸润与乳腺癌各组织学分型的生物学行为存在相关性，其发生率依次为硬癌＞浸润性导管癌＞乳头状腺癌。脉管浸润与淋巴结转移（P＜0.001）远隔转移（P＜0.005）有显著相关性，提示CD44基因蛋白产物的表达，与有脉管浸润，淋巴结转移、远隔转移及脉管浸润与组织学分型及生物学行为中有直接或间接意义。

综上所述，细胞黏附因子CD44S、CD44V6在乳腺癌转移、复发等生物学过程中，发挥着生物介导、粘附作用。CD44S、CD44V6在癌组织中的强表达提示肿瘤复发、转移、预后不良。肿瘤原发灶与转移灶间CD44S表达缺失或减弱可能与CD44单抗的抑制、阻止及蛋白终产物生物学效应的改变相关。CD44的变异性表达可作为早期诊断瘤细胞浸润转移、预后的生物学指标。CD34基因蛋白标记脉管内皮细胞，突出显现脉管形态学特征，可作为脉管内瘤细胞观察及血管、淋巴管鉴别的客观指标和方法。

［1］Yoshida R，Kimura N，Harada Y，et al.Th loss of E－cadlherinalpha－and bcta－catenin expression is associated with metastsis and poor prognosis in inyasive breast canccr［J］.Int J Oneol，2001，18（3）：513.

［2］Afify A，Purnll P，Nguyen L.Role of CD44sand CD44V6on human breast cancer cell adhesion migration and invasion［J］.Exp Mol pathol，2009，86（2）：95.

［3］张 真，张小涛，于 兰，等.乳腺癌CD44V6和Survivin的表达与临床预后的相关性研究［J］.中国肿瘤临床，2011，38（14）：835.

［4］Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44：from adhesion molecules to signaling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（1）：33.

［5］甄乐平，叶长生，刘民风，等.D2－40和CD34在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义［J］.南方医科大学学报，2010，30（7）：1548.