ELISA高通量筛选PIM靶向抑制剂的研究

尚琨张鹏周璐王瑧曹越李影奕

1.复旦大学附属肿瘤医院实验研究中心，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学药学院，上海 201203

ELISA高通量筛选PIM靶向抑制剂的研究

尚琨1张鹏2周璐2王瑧1曹越1李影奕1

1.复旦大学附属肿瘤医院实验研究中心，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学药学院，上海 201203

背景与目的：Pim家族是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的原癌基因，包括Pim-1、Pim-2、Pim-3。研究发现，Pim能够抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，导致肿瘤发生。本研究利用ELISA反应原理建立高通量筛选体系，对Pim抑制剂进行筛选，为药物的应用和解决恶性肿瘤临床治疗的难题提供研究基础。方法：通过计算机辅助药物设计的手段，以蔓生百部碱母核三环酰胺作为核心结构合成系列衍生物；利用Pim重组蛋白和Bad重组蛋白可以与Ni2+特异性结合的亲和层析原理进行重组蛋白的纯化精制；利用ELISA方法，通过Pim激酶磷酸化促凋亡蛋白分子Bad在112位丝氨酸的反应，建立筛选Pim靶向抑制剂的体系。结果：0.01 mmol/L的IPTG在37 ℃条件下，诱导Bad蛋白2 h，可以获得最大量的可溶性Bad重组蛋白；0.02%的阿拉伯糖在37 ℃条件下，诱导Pim-1、Pim-2、Pim-3蛋白3 h，可以获得最大量的Pim重组蛋白；ELISA结果显示，Pim激酶与Bad底物之间的作用存在剂量依赖性反应关系，进而成功建立药物筛选体系；初步筛选出低分子化合物T-18，在体外能有效抑制Pim激酶活性。结论：利用ELISA反应原理建立的筛选药物方法，是一种经济、简单、快速、高效、敏感的筛选手段，并初步筛选出小分子化合物T-18，能够抑制Pim激酶活性，阻断Pim对凋亡蛋白分子Bad的磷酸化过程，进而抑制肿瘤的发生。

Bad；Pim；ELISA,；药物筛选；Pim靶向抑制剂

［Key words］Bad; Pim; ELISA; Drug screening; Pim kinase inhibitors

Pim家族是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的原癌基因，包括Pim-1、Pim-2、Pim-3［1］。Pim蛋白对某些正常的或肿瘤细胞的增殖和细胞周期具有调节功能，能增强细胞的抗凋亡作用［2］。Pim-1最早是作为莫罗尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现［3］。同时，Pim-1激酶也是丝氨酸激酶和(或)苏氨酸激酶Pim家族的第一位成员，随后发现其也在前列腺癌［4］、急性髓细胞性白血病［5］等恶性肿瘤中过度表达。Pim-2也被证实为一个MMLV前病毒整合的共同位点，能导致T细胞淋巴瘤的发生［6］。Pim-2的反义核苷酸已被证实具有抑制前列腺肿瘤DU2145细胞系的增殖作用［7］。Pim-3最初是由大鼠细胞系PC12去极化诱导的基因而被首先报道［8］。最近研究发现，Pim-3蛋白在内胚层来源的肝癌［9］、胰腺癌［10］、结肠癌［11］和胃癌［12］组织中过度表达，而在正常组织中不表达，还发现在胰腺癌细胞株中，Pim-3通过磷酸化凋亡蛋白分子Bad，使其失活，从而抑制胰腺癌细胞的程序化死亡［10］。

在使用小分子化合物对肿瘤治疗的研究方面，蛋白激酶已成为一个主要的靶点［13］。针对Pim的抑制剂是通过与ATP竞争性结合Pim的ATP结合位点，抑制Pim激酶活性，从而抑制Pim的底物磷酸化，抑制肿瘤发生。我们之前的研究发现，以蔓生百部碱为基础合成的各种衍生化合物即是针对Pim的分子靶向治疗药物［14］，能够抑制Pim激酶活性，促进肿瘤细胞凋亡。因此，本实验是在此基础上通过ELISA实验建立高通量筛选体系，筛选出抑制Pim激酶的小分子化合物，为分子靶向治疗恶性肿瘤奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

大肠杆菌感受态细胞DL21和DL21(DE3)分别购自全式金生物技术有限公司和天根生化科技有限公司，IPTG和阿拉伯糖购自Sigma公司，考马斯亮蓝R250为Amresco公司产品，氨苄青霉素购自Sigma公司，卡那霉素购自天根生化科技有限公司，Bugbuster蛋白抽提试剂、核酸酶和溶菌酶为Merck公司产品，蛋白酶抑制剂为Roche公司产品，Ni2+填料为GE healthcare公司产品，尿素和咪唑购自经科宏达生物有限公司，ELISA专用96孔板为Merck公司产品，激酶缓冲液和ATP为Cell Signaling technology 公司产品，兔抗人pBad(Ser112)抗体为Cell Signaling technology 公司产品，碱性磷酸酶标记的二抗为Pierce公司产品，磷酸对硝基苯酯和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。

1.2 Bad蛋白的表达和纯化

含有人全长Bad cDNA核苷酸序列的重组质粒pET29a-Bad转入大肠杆菌感受态细胞DL21(DE3)中，在含有卡那霉素的培养基中培养，用分光光度计测得A值为0.4～0.6时，加入不同浓度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)的IPTG诱导Bad蛋白表达，37 ℃分别诱导2、3 h，以未加入IPTG作为阴性对照组，经过SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色后，确定能够最大诱导Bad蛋白产生的浓度和时间，并在此条件下，进行Bad蛋白的大量表达。

收集大肠杆菌菌体沉淀，加入蛋白抽提试剂Bugbuster(含有蛋白酶抑制剂和溶菌酶)，室温下摇床温育20 min，4 ℃离心收集上清液。将上清液加入到Ni2+柱中，随后依次加入漂洗缓冲液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L PBS、20 mmol/L咪唑，pH为8.0)和洗脱缓冲液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L PBS、250 mmol/L咪唑，pH为8.0)，收集纯化后的Bad蛋白，经SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色后确定纯度。

1.3 Pim蛋白的表达和纯化

含有人全长Pim-3 cDNA核苷酸序列的重组质粒pBAD/Thio-TOPO-pim-3转入大肠杆菌感受态细胞DL21中，在含有氨苄青霉素的培养基中培养，用分光光度计测得A值为0.4～0.6时，加入不同浓度(0.02%、0.1%、0.2%)的阿拉伯糖诱导Pim-3蛋白表达，37 ℃诱导3 h，以未加入阿拉伯糖作为阴性对照组，经过SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色后，确定能够最大程度诱导蛋白表达的浓度和时间。并分别取该浓度下的全菌液、上清液和沉淀，染色后确定蛋白的含量。大量诱导Pim-3蛋白，收集大肠杆菌菌体沉淀，加入蛋白抽提试剂Bugbuster(含有蛋白酶抑制剂和溶菌酶)，室温下摇床温育20 min，4 ℃离心收集沉淀。用8 mol/L尿素(pH为7.8)变性蛋白，4 ℃离心收集上清液加入到Ni2+柱中，随后依次加入漂洗缓冲液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸盐缓冲液、8 mol/L尿素，PH为6.0)和洗脱缓冲液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸盐缓冲液、8 mol/L尿素、200 mmol/L咪唑，pH为4.0)，收集纯化后的Pim-3蛋白，经SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色后确定纯度。最后对变性后的纯化蛋白通过透析的方式进行复性。

人全长Pim-1 和Pim-2 cDNA核苷酸序列插入到pBAD/Thio-TOPO载体中，Pim-1和Pim-2重组蛋白的精制方法同Pim-3。

1.4 ELISA筛选体系的建立

已有研究表明，Pim家族激酶能够使Bad(Ser112)蛋白发生磷酸化［10,15-16］，因此可以建立体外激酶活性检测体系。首先，96孔板每孔包被100 μL pH为9.6的碳酸盐缓冲液(含Bad蛋白3 μg/mL)4 ℃温育过夜。洗板3次后，PBS(1%BSA) 37 ℃封闭1 h，洗板3次，加入40 μL激酶缓冲液、ATP及各种不用浓度梯度的激酶30 ℃反应1 h。随后分别加入100 μL兔抗人pBad(Ser112)抗体和相应二抗，37 ℃反应1 h，最后每孔100 μL磷酸对硝基苯酯室温避光反应30 min进行显色，出现明显颜色差异时，用3 mol/L NaOH中止反应。利用多功能酶标仪检测405mm和450 nm时的A值。有些实验反应在ELISA反应液中加入一定浓度的小分子化合物一起温育。

1.5 蔓生百部碱合成中间体的制备

蔓生百部碱合成中间体依据前述制备［17］。合成顺序依次为T-10＞T-6、 T-10＞T-4＞T-5、T-10＞T-2＞T-3、T-10＞T-18。实验开始前将该化合物溶于DMSO中，终浓度为100 mmol/L。已有文献报道，T-2能够抑制Pim的活性，故此作为阳性对照；而T-10作为阴性对照［14］。

1.6 统计学处理

实验数据采用SPSS 17.0软件进行整理和统计分析。计量数据以表示，采用χ2检验和Student’s t-test对资料进行统计分析， P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 Bad蛋白诱导条件的确立和精制纯化

在IPTG浓度分别为0.1、0.5、1.0 mmol/L的条件下分别诱导Bad重组蛋白，以不加IPTG组为阴性对照。考马斯亮蓝染色结果显示，与阴性对照组相比较，在IPTG存在的条件下，检测到Bad蛋白表达条带，当浓度为0.1 mmol/L时检测到Bad重组蛋白表达量最多，其相对灰度值之间差异有统计学意义(P＜0.05)。而不同诱导时间的蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)，考虑到IPTG对大肠菌生长的毒性影响，我们选择采用0.1 mmol/L IPTG处理2 h，在37 ℃条件下，诱导表达Bad重组蛋白。纯化的Bad蛋白带有His标签，可以与Ni2+发生特异性结合，在低浓度咪唑条件下漂洗杂蛋白，高浓度咪唑条件下洗脱目的蛋白，根据这一原理，我们对Bad蛋白进行了纯化。考马斯亮蓝染色结果显示，只有单一目的条带(图1A、B)。提示Bad蛋白精制纯化成功，蛋白纯度可达到95%以上，能够用于体外Pim激酶反应。

2.2 Pim蛋白诱导条件的确立和精制纯化

在阿拉伯糖浓度分别为0.02%、0.1%、0.2%的条件下诱导Pim-3蛋白，以不加阿拉伯糖诱导组为阴性对照。考马斯亮蓝结果显示(图2A)，在阿拉伯糖存在条件下，检测到Pim-3蛋白表达条带，当浓度为0.02%时检测到Pim-3重组蛋白表达量最多，其相对灰度值之间有显著差异。

有文献报道，Pim家族蛋白为包涵体蛋白［18］。因此，本研究在0.02%阿拉伯糖条件下诱导Pim蛋白，分别取全菌液、沉淀、上清液检测(图2B)，Pim-3蛋白主要存在于沉淀中，是以包涵体的形式存在。因此，对其的纯化方法选用了变性复性的方式进行。本研究采用了同样的诱导条件诱导Pim-1和Pim-2重组蛋白的表达。

纯化的Pim蛋白带有His标签，可以与Ni2+发生特异性结合，根据这一原理，我们对Pim蛋白进行了纯化。洗脱下来的Pim蛋白在PBS缓冲液中，采用尿素浓度梯度透析方法复性。考马斯亮蓝染色结果显示，只有单一目的条带(图2C和图3)。提示Pim蛋白精制纯化成功，蛋白纯度可达到95%以上。

2.3 ELISA体系建立

图 1 IPTG诱导凋亡蛋白Bad的表达以及Bad重组蛋白的精制纯化Fig. 1 The expression of Bad protein induced by IPTG and the purification of recombinant Bad protein

图 2 阿拉伯糖诱导Pim-3重组蛋白的表达以及Pim-3重组蛋白的精制纯化Fig. 2 The expression of Pim-3 protein induced by arabinose and the purification of recombinant Pim-3 protein

图 3 Pim-1和Pim-2重组蛋白的精制纯化Fig. 3 The purification of recombinant Pim-1 and Pim-2 proteins

本研究利用体外Pim激酶活性测定体系，检测了上述精制纯化蛋白的活性。在不同Pim激酶剂量(0、10、20、40、80、160、320 ng)梯度条件下，检测其对底物Bad蛋白的磷酸化反应，结果显示，随着Pim激酶剂量的增加，A值呈现上升趋势，当Pim激酶达到一定剂量时，Bad的磷酸化达到饱和，随着Pim激酶剂量继续增加A值呈现平台期(图4)。提示Pim激酶活性测定的ELISA体系成功建立，可以用于分子靶向治疗药物的筛选。

图 4 ELISA方法测定Pim激酶活性Fig. 4 The determination of Pim kinase activity by ELISA

2.4 T-18可以抑制Pim激酶活性

Li等［14］的实验结果显示，蔓生百部碱合成中间体T-2可以在体内和体外抑制Pim-3的激酶活性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。本研究以T-2为先导化合物合成了一系列小分子化合物，利用体外Pim激酶活性测定体系，以T-10为阴性对照，T-2为阳性对照，对这些化合物进行了初筛。结果发现其中T-18可以一定程度抑制Pim激酶的活性(图5，表1)，并且T-18对Pim-1和Pim-2激酶活性的抑制程度与Pim-3类似(图5A)。显示Pim-1、Pim-2和Pim-3在激酶结构域中有类似结构。Akt/PKB蛋白激酶可以磷酸化相似的作用底物Bad。因此，我们进一步探讨了T-18对Akt1 和Akt2 激酶活性的影响。Akt1/2，是Akt1和Akt2激酶的特异性抑制剂，能明显抑制Akt1 和Akt2的激酶活性，而T-18对其没有抑制效果(图5B)。因此，T-18可能特异性地抑制Pim激酶活性。

3 讨 论

图 5 小分子化合物对Pim激酶活性的抑制作用Fig. 5 The inhibitory activities of stemonamide synthetic intermediates on Pim kinase.

表 1 小分子化合物对Pim激酶的半数抑制剂量Tab. 1 The inhibitory activities of stemonamide synthetic intermediates on Pim kinase

恶性肿瘤是人类生命的主要杀手之一，由于传统治疗手段存在的缺点，分子靶向治疗被认为是一种具有发展前景的治疗方法，而蛋白激酶则成为了一个主要的靶点。作为靶向分子，应该具备在正常组织中不表达，而在肿瘤组织中过度表达，并且在肿瘤细胞的过度增殖中起到了不可或缺的调节作用，Li等［10］认为，Pim具备作为靶向治疗分子的条件。因此，能够进一步筛选出针对Pim激酶活性的特异性强，单位抑制剂量范围内抑制效果更强的小分子化合物，将具有重要的科学意义和应用前景。而在筛选药物时，建立一个能够在普通实验室里完成，且经济、简单、快速、有效、高通量的体外筛选体系至关重要。

高通量药物筛选是一种优化的微量分析方法，是药物研制开发早期的最重要工具之一。利用这一技术能够快速地进行大量药物筛选，从中找到能选择性作用于靶点的具有生物活性的化合物［19］。其中， ELISA是一种极为敏感的检测方法，而且应用极为广泛。有报道显示，可以用ELISA方法高通量筛选拮抗性类肽药物防治自身免疫病［20］。因此，本实验也是通过建立ELISA体系筛选分子靶向药物。我们发现，Pim能够使凋亡蛋白分子Bad发生磷酸化，提示通过大肠杆菌提取的Pim蛋白具有激酶活性，并发现在不同剂量梯度下，Bad的磷酸化水平呈现上升趋势，并能达到饱和，根据Pim和Bad之间存在的这一剂量依赖性反应关系，进而成功建立药物筛选体系，并对能够抑制Pim激酶活性的分子靶向药物进行筛选，使获得的药物具备Pim选择性强以及单位剂量抑制性强的特点。

Akt也是具有丝氨酸/苏氨酸活性的蛋白激酶，与Pim-3有相似的作用底物。Akt也可以磷酸化促凋亡蛋白分子Bad，诱导肿瘤细胞过度增殖。Amaravadi等［21］认为，Akt是一个很好的靶向治疗分子。Rhodes等［22］报道Akt的抑制剂GSK690693在一期临床实验中显示了潜在的抗肿瘤活性。Akt-1、Akt-2、Akt-3广泛表达在各种正常组织和器官，参与正常的生理活动。有报道显示，敲除Akt的表达，可引起新生小鼠死亡、生长迟缓及脑发育不全［23-25］。Pim家族是选择性表达在一些组织器官。Pim-1、Pim-2、Pim-3同时敲除，对小鼠的生长没有显著影响［26］，提示Pim蛋白激酶在正常生理活动中不起主要作用。因此，开发针对Pim-3的抑制剂，其产生的不良反应小于Akt。本研究结果显示，与Akt特异性抑制剂Akt1/2相比，T-18能够抑制Pim家族成员，而对Akt-1和Akt-2没有明显抑制作用。因此，推测T-18可能特异性抑制Pim家族激酶活性，为今后裸鼠胰腺原位癌的研究和临床试验提供有力的实验数据，进而为进一步解决恶性肿瘤治疗的临床难题提供可行的方法。

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《抗癌》杂志征稿启事

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传 真：021-64043766 E-mail：anti-cancer@163.com

Screening of Pim kinase inhibitors by the establishment of high-throughput ELISA system

SHANG Kun1, ZHANG Peng2, ZHOU Lu2, WANG Zhen1, CAO Yue1, LI Ying-yi1(1.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

LI Ying-yi E-mail: liyingyi@fudan.edu.cn

Background and purpose: Pim family is the proto-oncogene that exhibits serine/threonine kinase activity, containing Pim-1, Pim-2, Pim-3. Pim family has potent anti-apoptotic capacity, ultimately promoting tumor cells survival. This study aimed to establish a high-throughput system to screen the anti-cancer drugs targeting Pim kinase by ELISA. Methods: The stemonamide synthetic intermediates were synthesized using a radical cascade. The expression of Pim kinase proteins and Bad proteins were purified by bacterial system. A high-throughput ELISA screening was performed for in vitro Pim kinase assay. Results: Treatment with 0.01 mmol/L of IPTG for 2 hours at 37 ℃, the induction of Bad recombinant proteins was the maximum; Treatment with 0.02% of arabinose for 3 hours at 37 ℃, the induction of Pim-1, Pim-2, Pim-3 recombinant proteins was the maximum. ELISA results showed that the Pim kinase could phosphorylate Bad in a dose-dependent manner; we had found a low molecular weight compounds T-18, which could effective inhibit Pim kinase activity in vitro. Conclusion: We successfully established a screening system with Bad and Pim by ELISA. ELISA is a method for screening drug with high throughput, effect and sensitivity. Moreover, small molecule the compound T-18 that is screened by ELISA, can inhibit Pim kinase activities, ultimately reduce the amount of phosphorylated Bad and could induce apoptosis.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.004

R73-34

：A

：1007-3639(2013)04-0260-07

2012-08-02

2013-01-20）

国家自然科学基金面上项目(No：30973476)；上海市浦江人才计划(No：10PJ1402100)；复旦大学“985工程”三期肿瘤研究项目Ⅱ (No：985Ⅲ-YFX0102)。

李影奕 E-mail:liyingyi@fudan.edu.cn