十字花科根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）致病力分化研究方法

苗则彦，白元俊，李 颖，赵 杨，赵奎华

（辽宁省农业科学院，辽宁省农作物有害生物控制重点实验室，沈阳 110161）

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一种重要病害，世界各地均有发生，我国云南、四川等地该病的发生面积已超过65%，严重田块的产量损失超过50%[1]。2011年调查发现辽宁省沈阳市新民地区严重地块发病率达到90%以上，直接危害十字花科作物生产。培育抗病品种是防治十字花科根肿病的最有效措施之一。由于该病原菌存在明显的致病力分化现象，因此明确病原菌的生理小种或致病型类型十分重要。目前我国关于根肿病菌生理小种鉴定报道很少，谢文瑞等利用ECD（European club root differential host）方法测定台湾省7个地区的根肿病菌生理小种，分别为ECD16/0/0和ECD16/0/31菌系[2]。沈向群首次利用Williams方法明确我国大白菜根肿病菌生理小种主要种群分布，鉴定出4号、2号、7号、10号、11号生理小种[3]。国际上除Williams[4]和ECD[5]鉴别系统之外，还有Somé[6]和Kuginuki[7]鉴别系统，我国目前无这两种鉴别系统的应用和介绍。

根肿病菌是一种专性寄生菌，寄生于寄主根部薄壁组织内或以休眠孢子存在于土壤中，体外培养根肿病菌均未获得成功，该病原菌的扩繁只能通过活体寄生的方式完成。根肿病菌的休眠孢子体积较小难于分离和检测，单个病原菌孢子的分离和扩繁成功率极低，为根肿病菌生理小种的深入研究带来困难。杨佩文研究了根肿病菌休眠孢子的分离技术[8]，但单孢子分离方法，单个孢子接种方法为我国研究空白。本文对根肿病菌生理小种或致病型鉴别系统、病原菌单孢子分离方法及病原菌接种方法进行综述。

1 生理小种鉴别系统

Honig在1931年首先发现十字花科作物根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）存在致病力分化现象[9]，Ayers和Lammerink对该病原菌分化进行研究[10-11]。很多学者利用不同鉴别方法，在世界不同地区如欧洲[5-6,12]、亚洲[13]、大洋洲[14]、北美洲[15]等陆续报道不同十字花科作物上的根肿病菌致病力分化情况。

国际上已有4套鉴别系统用于根肿病菌生理小种和致病型的鉴定，Williams和ECD鉴别系统应用较为广泛，刘勇已就这两种鉴别方法及优缺点进行较全面的综述[16]。Somé和Kuginuki鉴别系统克服Williams和ECD鉴别系统中的部分缺欠，在国际上已被部分研究人员应用。

1.1 Somé鉴别系统

Somé在研究法国根肿病菌时发现Williams和ECD鉴别系统具有一定的局限性，可能是不同地域病原菌致病型不同的原因[6]。这两套鉴别系统不能将病原菌明确区分。因此，Somé选用ECD鉴别系统中的两个品种Nevin（ECD06）和Wilhelmsburger（ECD10），又另外选用Brutor品种（Spring oilseed rape），建立由3个品种组成的鉴别系统[6]，根据Somé[6]研究结果，建立能区分8种致病型的鉴别寄主谱（见表1）。Crute等[17]和Voorips[12]曾提出用致病型（Pathotype）代替生理小种（Race）的概念，Somé鉴别系统中病菌的分类采用致病型而非生理小种[6]。研究人员均使用这个系统进行根肿病菌致病型的鉴定[15,18]。ECD、Williams和Somé鉴别系统分别含有15个、4个和3个鉴别寄主，理论上相应可鉴定出125个、16个和8个致病型，因此在ECD中鉴定为不同的致病型在Williams和Somé鉴别系统中为同一种致病型的概率相对较高。Williams和Somé鉴别系统的鉴别寄主少，实用性和可操作性更强，Somé根据法国根肿病菌的分化特点，虽然仅选用3个鉴别寄主，但可对病原菌的致病型进行有效鉴定，值得各国学者研究和借鉴。

1.2 Kuginuki鉴别系统

Kuginuki在研究日本根肿病菌时发现，利用Williams和ECD鉴别系统很难将根肿病菌致病型真正区分开来[7]。利用日本抗性品种杂交F1代和Brassica rapa品种可以进一步区分在Williams和ECD鉴别系统中认为是相同生理小种的菌株。Kuginuki选用Willams鉴别系统中的4个品种，选用ECD鉴别系统中的ECD05、ECD04、ECD03、ECD02、ECD01品种，选用日本的抗性品种杂交F1代CR W-1116、CR Kukai 65、CR Kanko、CR Utage 70、CR Ryutoku、Muso，另外选用Gelria R、Siloga、Chinese cabbage parental line No.4共18个品种用于病原菌的鉴定[7]。Hatakeyama在Kuginuki鉴别系统的基础上，对鉴别寄主的种类稍加改变，试验又一次证明Williams和ECD鉴别系统不能有效区分小种类型，Hatakeyama和Kuginuki鉴别系统在日本的根肿病菌小种鉴定中起重要作用，它比Williams和ECD鉴别系统更加精确，但鉴别寄主较多且适用地区有限[15]。

目前国内使用Willams鉴别系统，已鉴定出4号生理小种，且在我们的研究中发现4号生理小种已成为东北地区的优势小种，根据Willams鉴别系统的命名原则，使4个鉴别寄主全部感病时的病原菌菌株为4号生理小种。可以预见当病原菌致病力进一步分化，出现致病力强于4号生理小种时，Willams鉴别系统将不能满足鉴定需要，当前亟需调整和补充新的鉴别寄主。因此有必要学习和借鉴Somé和Kuginuki鉴别系统的制定过程，形成一套新的适合我国根肿病菌鉴定的鉴别寄主谱。

表1 Somé十字花科根肿病菌鉴别系统Table 1 System for the determination of pathotype of Plasmodiophora brassicae with Somé

2 病原菌单孢子分离方法

研究人员直接用田间发病的根部肿块制成孢子悬浮液进行人工接种，完成生理小种或致病型的鉴定[6,19-20]。Strelkov等研究发现，人工接种鉴别寄主后，病情指数波动较大或出现既不属于抗病反应也不属于感病反应的中间类型，难以命名生理小种或致 病 型[21]。Williams[4]，Kuginuki[7]，Toxopeus[22]也 发现同样现象。Williams[4]和Toxopeus[22]认为可能是病原菌存在异质性。Xue等研究发现在同一地块的根肿病菌有多种致病型同时存在[18]。Kuginuki认为可能是鉴别寄主存在遗传异质性[7]。目前已有相当多的学者采用单孢子分离物（Single resting sporederived isolates）来进行根肿病菌生理小种鉴定研究[17-18]，利用单个休眠孢子分离方法可比较准确评估病原菌的毒力，有助于研究寄主和病原物之间的相互关系[6]，因此相继出现病原菌单个休眠孢子分离技术，即琼脂法和液滴法。

2.1 病原菌单孢子分离方法—琼脂法

Tinggal和Webster最先使用琼脂法[23]。Jones等进行改进[20]，他将根肿病菌孢子悬浮液稀释为3×104个·mL-1，取一滴菌悬液放在含有3%的琼脂平板上，散开后用160倍的显微镜观察，当1个孢子与其他孢子明显分开时，用显微镜上的微型打孔器来切取带有孢子的圆形琼脂饼，并检测这个琼脂饼是否移出。这种方法比平针挑取法好，降低了挑出其他孢子的可能性。Xue等研究表明，如果不借助特殊仪器，移出一小块琼脂很难，另外琼脂可能会阻止孢子直接接触根毛影响接种效果[18]。

将甘蓝（Brassica oleracea）种子放在装有湿滤纸的培养皿中萌发，24 h后将发芽的种子放在一个直径为5 mm的滤纸片上，将这个滤纸片放在装有无菌肥料的直径为9 cm的塑料盆表面，并置于高湿条件下培养5 d（高湿条件十分必要）。胚根长到肥料中，茂密的根须布满滤纸片，在根须上滴一滴根的浸出液。用一个细的金属丝挑起含有单个根肿病菌孢子的琼脂块放在液滴里。接种后用塑料袋保湿，25℃黑暗培养，避免光照，以免影响孢子萌发。2 d后将塑料袋移走，将塑料盆放在未感染根肿病菌的温室中。用灭菌的导管向盆中浇水。接种约9周后，小心地将植株从肥料中取出，调查病害发生情况。没有病菌接种的幼苗随机排列在接种幼苗中，当未接种幼苗没有出现根肿症状时，表明试验成功。Fahling等将孢子悬浮液进行纯化，通过2次梯度离心[2 000×g，15 min，16%和32%（W/V）蔗糖]收集32%（W/V）离心后的上清液，水洗，配成孢子悬浮液104个·mL-1，取100 μL孢子悬浮液在薄的1%琼脂上散开，30 min后将琼脂切成0.5 mm2小块，用两个针在显微镜下将含有1个孢子的琼脂小块取出，放在已萌发4 d的根表面，10周后发病植株根部表现症状。

Somé将孢子悬浮液经过500、250和100 μm膜过滤，孢子在5 000 r·min-1、4℃下离心5 min，弃上清将沉淀用蒸馏水重新悬浮，反复4次[6]。将沉淀物贮存在4℃条件下，使用期限不超过5 d。取1%琼脂倒在一玻片上，加一滴孢子悬浮液在其表面扩散，几分钟后表面风干，用刀切成1 mm2小块，用针将含有一个孢子的琼脂块取出，放在已萌发3～6 d的白菜根上（生长在蛭石上），保湿、20℃、黑暗24～48 h后移入装有无菌土∶泥炭土（1∶1）直径8 cm的塑料盆中，置于夜晚19℃、白天21℃、16 h光照的生长箱中，接种9～14周后发病，成功率大约为9.6%。

2.2 病原菌单孢子分离—液滴法

Xue取新鲜、-80℃贮存或在4℃下密封袋中保存2个月的部分腐烂根肿瘤3 g，加入50 mL无菌水中，用搅拌器制成匀浆，8层纱布过滤，将含有休眠孢子的滤液进行离心（1 000×g，4℃，10 min），沉淀物用无菌水悬浮再离心5次，将沉淀物保存在4℃下备用，保存期限不超过2 d[18]。

将休眠孢子悬浮在磷酸钠盐缓冲液（pH 8.0，10 mmol·L-1）或5%（V/V）甘油溶液中，浓度为2×103个·mL-1。Xue等认为用5%的甘油配制孢子悬浮液可避免孢子集聚[18]。取1滴0.5 μL孢子悬浮液置于100倍显微镜下观察，当确认只有1个孢子时，轻轻吸取液滴，接种于已萌发1～2周的白菜苗根部。将苗置于垫有滤纸的培养皿中，皿中加入无菌水（pH 6.5～7.0）或自来水（pH 6.0），可用HCl调pH，然后置于21℃、黑暗条件下，培养2 d后移栽到直径7.5 cm装土的塑料钵中，光照24℃、黑暗18 ℃，每天光照16 h（180 μmol·m-2·s-1），加入pH 6.0自来水，使土壤始终处于饱和状态，培养19 d后，可1周施肥1次（15N-30P-15K）。Xue等认为，在吸取液滴的过程中可能会使相当多的孢子留在移液管末端或留在玻片中，导致侵染率降低[18]。这种方法只要孢子悬浮液浓度适宜，每小时可接种2～4个幼苗，接种成功率达到4%～17%。

Voorrips则将孢子悬浮液稀释为500个·mL-1[24]。吸1滴2 μL孢子悬浮液放在已灭菌的盖玻片上，在显微镜300倍下逐行仔细观察，如果只有1个或没有休眠孢子，则再仔细观察1遍，如果确定有1个孢子，则在450倍下再重新观察确定。用含有1个或0个休眠孢子的悬浮液进行接种。用萌发5～8 d白菜苗（品种：ECD05）的根放在盖玻片上去吸这滴孢子悬浮液。随后将这株幼苗移入1.5 mL离心管中，取1 mL无菌水冲洗盖玻片，并将洗液冲入离心管中，在培养箱（23 ℃，80 μE·m-2·s-1，每天光照16 h）中培养，48 h后放入18℃温室中，用无菌复合肥盆栽。试验设置不接种为对照，7周后调查，结果表明分离的164个单个休眠孢子只有2株接种成功，161滴0个休眠孢子的悬浮液接种后，没有表现出症状，160个未接种对照植株没有发病。试验本身是成功的，但接种效率很低。Kageyama等将孢子悬浮液稀释为2×103个·mL-1，吸取0.5 μL放在载玻片上，显微镜检查后确认只有1个孢子时，将这个载玻片放在灭菌土表面，已萌发1 d的幼苗放在液滴上，上面覆盖少量无菌土[25]。也许因为休眠孢子吸附在盖玻片上，这种方法的侵染率很低，为0～4.2%。

3 病害鉴定方法及分级标准

蘸根法、点滴法和菌土法是目前根肿病菌生理小种或致病型鉴定采用的主要方法，但不同研究人员采用的病原菌接种浓度不同、接种后植株管理条件不同以及抗、感病反应型确定的临界点不同等，使得试验结果缺乏可比性。国内部分学者对根肿病菌最佳接种方法[26-27]和适宜病原菌接种浓度[28]等进行研究报道，试验选用的品种为非鉴别寄主品种，感病性不同且试验目的存在差异，还不能视为对生理小种鉴定方法的研究。一定区域内根肿病菌生理小种或致病型的鉴定应采用统一方法，严格规范试验条件，避免产生人为误差，国内目前缺乏规范的不同十字花科作物生理小种鉴定方法的研究。

3.1 蘸根法

Strelkov取2.5～3 g干的根肿瘤加入研钵中研磨，加入50 mL灭菌蒸馏水，8层纱布过滤，将孢子浓度配制成2×107～3×108个·mL-1，将在无菌滤纸上萌发7 d的幼苗根部浸在孢子悬浮液中，10 s后置于6 cm3的塑料钵中，浇透水后放在培养室中[15]。白天21℃/夜间18℃，16 h光照，或放在温室中（20±2）℃，16 h光照。接种后1周内土壤水分始终处于饱和状态，然后根据需要进行浇水、施肥。每个品种24株，4次重复。Xue用无菌水将根肿病菌配成浓度为1×107个·mL-1孢子悬浮液[18]。在无菌滤纸上萌发种子，7 d后将白菜根浸在孢子悬浮液中，10 s后置于4 cm2的塑料钵中底部无排水孔，温室大棚中白天21℃，16 h光照（自然光补充高压钠灯）夜间18℃黑暗，接种后1周，用自来水（pH 6.0）浇透，以后每周施肥1次（15N-30P-15K）。接种6周后调查病害发生程度，病情分级标准：0级：无症状；1级：有少量小根瘤，体积少于根的1/3；2级：中度结瘤，小的和中等大小的肿瘤，体积是根的1/3至1/2；3级：重度结瘤，中等至大的肿瘤，体积超过根的2/3。Voorrips等认为孢子悬浮液最小浓度为1.0×107个·mL-1是接种成功的最适宜浓度[29]。Strelkov将DI=50%做为抗感反应的临界点，DI≥50%为感病反应，DI＜50%为抗病反应。Xue则利用方差分析和LSD（Least significant difference）进行抗病反应和感病反应分析[18]。

3.2 点滴法

Somé建立自己的鉴别系统，采用点滴法进行接种[6]。将泥炭∶土壤∶沙子（2∶1∶1），pH 5.5～6.3的基质装入7.5 cm2塑料盆中，每盆播5粒种子，种子萌发6～10 d后接种。用移液管在植株根部滴入1 mL孢子悬浮液，浓度为2×107～1×108个·mL-1，每个品种10～20株。土壤保持湿润，接种5～6周后调查。分级标准：n0：无症状；n1：次生根上长小的肿瘤；n2：侧根上长有很多肿瘤；n3：主根和次生根上长有大量肿瘤。抗感反应临界点为25%。Somé在参照Williams计算方法的基础上进行改进，采用不同于普遍应用的病害病情指数计算公式。

Agarwal等将种子播种在装有无菌土的直径125 mm的育苗盒中，每盒放1粒种子，然后将育苗盒置于温室中（20±2）℃。15个品种12次重复，共180株[30]。播种后3～4周（2片真叶期）接种，接种前土中浇水，在土壤表面滴入200 μL孢子悬浮液（108个·mL-1），8周后调查病害发生情况。0=无症状；1=肿瘤占根体积低于10%；2=肿瘤占根体积10%～50%；3=肿瘤占根体积多于50%。病情指数DI=0为抗性反应，DI≥33%为感病反应。

3.3 菌土法

Kuginuki等利用菌土法进行接种，将无菌土装入8 cm2盆中（土壤pH 5.5～6.0），在其中挖一个6 cm长、2 cm宽、3 cm深的坑，将菌土（5×106个孢子·g-1干土）放入其中[7]，每盆播1个种子，每个品种播10粒种子3次重复。0级：根部无肿瘤；1级：少量小的肿瘤；2级：中等肿瘤；3级：严重肿瘤。

4 展望

十字花科根肿病几乎在全国范围内发生，随着研究的不断深入，目前亟需建立一套科学、实用、适合我国病原菌致病力分化特点的鉴别系统。应该筛选出适易的鉴别寄主、摸索出准确快速的病原菌单孢子分离方法，规范病原菌人工接种过程，建立以大白菜、萝卜、甘蓝等不同十字花科作物的生理小种或致病型鉴定规程。

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