寒地粳稻耐盐愈伤组织生理特性及再分化研究

赵宏伟，萨日娜

（东北农业大学水稻研究所，哈尔滨 150030）

水稻（Oryza sativa）是我国城乡居民的主要口粮之一，东北是全国粳稻主产区。黑龙江省水稻产量在东北稻作区占有举足轻重位置，其种植面积占东北稻作总面积的58.1%[1]。盐害是影响大田作物生产的严重问题，近年来随着自然生态环境的恶化及人为破坏，干旱频繁发生，灌溉方式不合理等造成的土壤盐渍化越来越严重，盐渍化土壤面积越来越大。

水稻是一种对盐碱中度敏感的作物[2]，土壤盐碱化不利于水稻生长，因此选育水稻耐盐新品种是实现盐渍化区域稻作高产、稳产的重要途径[3]。常规育种方法效率低且周期长，近年来运用组织培养技术在耐盐品种的筛选方面取得一定进展[4]。本试验以两个寒地粳稻品种长白3和龙稻9为试验材料，分析在不同NaCl浓度胁迫下，胚性愈伤组织的生长量、生理特性及其分化能力，并获得再生植株，为北方寒地粳稻利用组织培养技术选育耐盐突变体的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

龙稻9，粳型常规糯稻，黑龙江省农业科院耕作栽培研究所提供。

长白3，粳型常规水稻，吉林省农业科学院水稻研究所提供。

1.2 试验设计

1.2.1 耐盐突变体的选择培养

采用逐步提高培养基NaCl浓度的方法，即把继代培养基上培养2代的愈伤组织转移到50 mmol·L-1NaCl的培养基上选择培养2代，每代1周。选择生长良好的愈伤组织切成小块（直径为2～3 mm），转移到高浓度的培养基上选择培养，每个培养基接12块。依照此方法在每个不同浓度NaCl的培养基上选择培养2代。选择培养的同时，调查记录愈伤组织生长量，并把部分生长良好的愈伤组织移入分化培养基上（于27℃光照培养，光强约2 000 lx，每日光照12 h）诱导再生植株。

1.2.2 试验中有关指标的测定

①愈伤组织生长量（g）=培养后的愈伤组织重量-培养前的愈伤组织重量；

②愈伤组织相对生长量（%）=愈伤组织生长量/培养前愈伤组织重量×100%；

③脯氨酸含量测定采用茚三酮法；

④丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法；

⑤绿苗分化率（%）=长出绿苗的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数×100%。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配置

①诱导培养基：诱导和增殖愈伤组织，NMB（N6大量元素+MS微量元素+B5有机物），附加2，4-D 2 mg·L-1，6-BA 1 mg·L-1，蔗糖3%，水解酪蛋白0.03%，琼脂粉0.7%，pH 5.80。

②选择培养：在诱导培养基基础上分别加入50、100、150 mmol·L-1NaCl，以不加NaCl的培养基为对照，pH 5.80。

③再分化培养基：基本成分是MS，培养基附加6-BA 3 mg·L-1，NAA 1 mg·L-1，蔗糖3%，水解酪蛋白0.03%，琼脂粉0.7%，pH 5.80。

1.3.2 培养条件

愈伤组织的诱导：选取饱满成熟的水稻种子，剥去颖壳选取干净完整的颖果。在超净工作台内先用70%酒精处理1 min，无菌水冲洗3～4次，再用10%的次氯酸钠处理10 min，然后用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干后，接种于固体诱导培养基。每个培养皿接种20～23个外植体，在24～26℃条件下暗培养12 d，诱导愈伤组织形成。

愈伤组织的继代培养：将诱导出的愈伤组织切下来，转移到继代培养基上，24～26℃暗培养2周。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对水稻愈伤组织生长的影响

水稻成熟胚诱导出的愈伤组织继代1次后，采用逐步提高培养基中NaCl浓度的方法，在每个培养基中选择培养两代，调查生长量。由表1可知，随着培养基中NaCl浓度的提高，水稻愈伤组织鲜重生长量逐步降低。2个品种表现出同样的变化趋势，对照的鲜重生长量最多，为3.48和3.54 g，而在150 mmol·L-1浓度下其生长量最少，低至1.29和0.81 g。

相对生长量是增重量占总重量的比例，更能体现出不同NaCl浓度处理下愈伤组织在单位时间内鲜重生长的速度，相对生长量越高生长能力越强。由图1可知，随着培养基中NaCl浓度的提高，2个水稻品种愈伤组织相对生长量变化趋势基本相同，均呈下降趋势，降低程度因不同基因型品种而异。在相同NaCl浓度下，长白3愈伤组织相对生长量高于龙稻9。NaCl浓度低于50 mmol·L-1时，长白3愈伤组织相对生长量差异不大，NaCl浓度高于100 mmol·L-1时，愈伤组织相对生长量降低程度较为明显，当NaCl浓度增至150 mmol·L-1时，愈伤组织相对生长量降低至10%以下，这说明NaCl浓度在100 mmol·L-1时已开始抑制愈伤组织的生长；龙稻9愈伤组织在50和100 mmol·L-1浓度下，相对生长量降低程度较为平均，但比较0和150 mmol·L-1浓度时发现，愈伤组织相对生长量明显降低，从23.62%降低至8.67%。这说明浓度在150 mmol·L-1时明显抑制愈伤组织生长。因此，可以把100 mmol·L-1作为长白3筛选耐盐突变体的选择剂量；把150 mmol·L-1作为龙稻9筛选耐盐突变体的选择剂量。

表1 不同NaCl浓度处理下愈伤组织的生长量Table 1 Callus growth under different NaCl concentration treatments

图1 不同NaCl浓度处理下愈伤组织相对生长量Fig.1 Callus relative growth under different NaCl concentration treatments

2.2 盐胁迫对水稻愈伤组织脯氨酸含量的影响

由图2可知，随着NaCl浓度的提高，水稻愈伤组织脯氨酸含量呈先增加后下降的趋势，2个水稻品种的变化趋势相同，而脯氨酸含量因不同基因型品种而异，除对照外，长白3愈伤组织脯氨酸含量都高于龙稻9，且在50和100 mmol·L-1浓度下最为明显。2个水稻品种愈伤组织脯氨酸含量均在100 mmol·L-1浓度下最高，在150 mmol·L-1浓度下降低，且较对照都有所增加。

2.3 盐胁迫对水稻愈伤组织丙二醛含量的影响

由图3可知，随着NaCl浓度的提高，水稻愈伤组织丙二醛含量呈先上升后下降再上升的趋势，2个水稻品种的变化趋势相同，丙二醛含量因不同基因型品种而异，除对照处理外，长白3愈伤组织丙二醛含量都高于龙稻9，且在50 mmol·L-1浓度下最为明显。2个水稻品种愈伤组织在50、100和150 mmol·L-1浓度下丙二醛含量均较对照成倍增加，以长白3为例，它在50、100和150 mmol·L-1浓度下丙二醛含量较对照分别增加3.95倍、1.93倍和2.53倍。

图2 不同NaCl浓度处理下愈伤组织脯氨酸含量Fig.2 Pro content under different NaCl concentration treatments

图3 不同NaCl浓度处理下愈伤组织丙二醛含量Fig.3 MDA content under different NaCl concentration treatments

2.4 盐胁迫后水稻愈伤组织再分化情况

水稻愈伤组织经逐步选择培养2代后，每个处理选择生长良好的愈伤组织，切成相同大小的小块，转接到分化培养基上，调查绿点数、绿苗数及分化率。

由表2可知，随着培养基中NaCl浓度的提高，除龙稻9在100 mmol·L-1浓度外，2个水稻品种的愈伤组织再分化率均呈现下降趋势。2个水稻品种的愈伤组织在低浓度NaCl处理下，长白3的再分化率高于龙稻9，但随着NaCl浓度的升高，长白3的再分化率反而比龙稻9的低。如相同NaCl浓度50 mmol·L-1下，长白3的再分化率较龙稻9高出12.47%，而在150 mmol·L-1浓度下，长白3的再分化率较龙稻9低6.25%。2个水稻品种愈伤组织均在150 mmol·L-1浓度下再分化率明显降低，为18.75%和12.5%。

表2 不同NaCl浓度处理下水稻愈伤组织再分化率Table 2 Callus differentiation rate under different NaCl concentration treatments

3 讨论

本试验以2个寒地粳稻品种成熟胚诱导出的愈伤组织为试验材料，以NaCl为诱变剂进行耐盐突变体筛选，通过对愈伤组织生长速率的研究，确定最适的选择计量[5]。李洪建试验证明，不同基因型品种筛选耐盐变异体合适的选择剂量亦不相同[6]。试验结果证明，长白3筛选耐盐变异体合适的选择剂量为100 mmol·L-1，龙稻9为150 mmol·L-1。

脯氨酸是一种渗透调节剂，在植物渗透调节中主要积累溶质。在干旱、盐渍等胁迫条件下，水稻体内脯氨酸大量积累，降低细胞的渗透势，适应外界的低水势[7-8]。谢国生等研究表明，盐碱胁迫下水稻幼苗脯氨酸的积累程度是反映水稻幼苗伤害程度的重要指标之一[9]。本试验中，2个水稻品种的愈伤组织在不同NaCl浓度处理下，脯氨酸积累趋势相同，除对照外，长白3愈伤组织脯氨酸积累量均高于龙稻9。赵勇等指出，盐胁迫下植物组织中脯氨酸含量可以作为一种盐胁迫的伤害指标[10]，因此长白3愈伤组织在盐胁迫下更容易受到伤害。2个水稻品种的愈伤组织，随着NaCl浓度的升高脯氨酸积累增多，这与刘展基等研究结果一致[11]，100 mmol·L-1处理时脯氨酸积累达最大值，随后减少，150 mmol·L-1时出现转折点，但愈伤组织中脯氨酸积累量都较50 mmol·L-1对照多。

植物遭受逆境伤害时通常会发生膜脂过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量高低可体现植物遭受逆境伤害的程度[12]，并且可作为耐盐性筛选的生理指标[13]。本试验中，2个水稻品种愈伤组织在不同NaCl浓度处理下，丙二醛含量增加趋势相同，除对照外，长白3愈伤组织丙二醛含量都高于龙稻9，因此本试验结果可说明龙稻9愈伤组织的耐盐性较长白3高。本试验中，2个水稻品种愈伤组织中的丙二醛含量，随着NaCl浓度的升高均呈先上升后下降再上升的趋势，出现2个转折点，当NaCl浓度在50 mmol·L-1时愈伤组织中丙二醛含量最多，说明50 mmol·L-1时遭受的盐伤害比其他处理大，这与范晶等研究结果不同，随着盐浓度的增加番茄植株丙二醛含量呈上升趋势[14]。

近年来利用细胞和组织培养技术进行离体筛选，已获得一批耐盐突变体[15]。陈香兰等应用组织培养方法培育出耐盐碱水稻新品种[16]。本试验中，2个品种水稻愈伤组织在不同NaCl浓度培养基中选择培养，再转接到分化培养基中，第6天开始绿点分化，第12天绿点分化基本结束开始分化绿苗，NaCl浓度为50 mmol·L-1时最早分化绿点，低浓度的NaCl促进愈伤组织分化。除龙稻9的100 mmol·L-1处理外，2个品种水稻的愈伤组织再分化率随着NaCl浓度升高而减少。在低NaCl浓度处理下，长白3的再分化率高于龙稻9，而在高NaCl浓度处理下则相反，这表明龙稻9愈伤组织的耐盐性较长白3强。

4 结论

采用逐步提高培养基中NaCl浓度的方法，对寒地粳稻长白3和龙稻9成熟胚诱导出的愈伤组织进行选择培养后发现，其生长量、脯氨酸含量和丙二醛含量较对照都有所提升，但再分化率随着NaCl浓度的升高而减少；2个寒地粳稻成熟胚诱导出的愈伤组织经不同NaCl浓度处理后，生长量、脯氨酸含量和丙二醛含量变化趋势均相同，长白3愈伤组织中各生理指标含量均高于龙稻9，且在较高NaCl浓度处理下长白3的再分化率低于龙稻9，证明龙稻9愈伤组织的耐盐性较长白3强。

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