黄芪注射液联合葛根素注射液对2 型糖尿病KKAy小鼠肾脏TGF－β1和BMP－7 表达的影响*

李姝玉， 柴新楼， 吴 莹， 贾德贤， 郝 钰， 苏玮莲， 王 谦△

(1北京中医药大学基础医学院，北京100029;2天津医科大学，天津300070)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见而难治的微血管并发症，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。在DN 发病过程中，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)起着关键的作用，可以促进糖尿病肾小球纤维化和间质纤维化过程的发生、发展。而骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)是近年来发现的一种内源性肾脏保护因子，具有抗纤维化的作用，能够拮抗TGF－β1的作用。黄芪和葛根是治疗DN 的常用中药，能有效改善肾脏功能，然而，其作用机制尚缺乏充分了解。因此，本研究观察黄芪注射液联合葛根素注射液对2 型糖尿病肾病模型KKAy小鼠肾脏TGF－β1和BMP－7 表达的影响，探讨黄芪注射液和葛根素注射液治疗DN 的有关作用机制。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF 级KKAy小鼠40 只，雄性，9 ～11 周龄，25 ～28 g，购自中国医学科学院动物中心，许可证号为SCXK(京)2005－0013，随机血糖≥13.9mol/L，确定为糖尿病小鼠。C57BL/6J 小鼠18 只，雄性，9 ～11周龄，23 ～25 g，许可证号为SCXK(京)2003－0003，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验期间，动物自由饮水，KKAy小鼠给予高脂饲料(中国医学科学院动物中心提供)，C57BL/6J 小鼠给予生长维持颗粒饲料(购自北京科奥协力饲料有限公司)，以上动物均饲养在中日友好医院临床研究所实验动物中心屏障系统。

2 药物与试剂

黄芪注射液购自成都地奥九泓制药厂，规格为每毫升含生药2 g，产品批号为0608056。葛根素注射液购自浙江康恩贝制药股份有限公司，规格为每毫升含葛根素50 mg，产品批号为0601013。TGF－β1兔抗多克隆抗体和DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 及高敏过氧化物复合酶购自武汉博士德生物工程有限公司。Trizol 购自Invitrogen，RT－PCR有关试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;引物由赛百盛基因技术有限公司合成，TGF－β1上游引物序列5'－TCCCTCAACCTCAAATTATTCA－3'，下游引物序列5'－GCGGTCCACCATTAGCAC－3'，扩增后片段长度为493 bp;BMP－7 上游引物序列5'－GACGCCAAAGAACCACAAGAG－3'，下游引物序列5'－TCACAGTAGTAGGCAGCATAGC－3'，扩增后片段长度为165 bp;β－actin 上游引物序列5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAGG－3'，下游引物序列5'－CACGTCACACTTCATGATGGAG－3'，扩增后片段长度为243 bp。

3 主要仪器

Freestyle 利舒坦血糖仪，日立7600P 全自动生化分析仪，Eppendorf RT－PCR 仪，紫外分光光度计，凝胶成像仪。

4 方法

4.1 动物分组及给药方法 KKAy小鼠饲养至14周龄时，将其按照随机血糖分组:模型组(model group，MG)20 只;治疗组(treatment group，TRG)20只，每日腹腔注射黄芪注射液(3 mL·kg－1·d－1)和葛根素注射液(1.3 mL·kg－1·d－1)，2 种药物先后给药。18 只C57BL/6J 小鼠作为正常组(normal group，NG)。实验期间，各组动物自由饮食、饮水。分别于20 周龄、24 周龄和28 周龄处死动物。

4.2 小鼠一般状态及体重变化 每天观察小鼠一般状态，隔周称量各组小鼠体重。

4.3 血清生化指标检测 剪尾检测20 周龄、24 周龄和28 周龄各组小鼠空腹血糖(blood glucose，BG)。20 周龄小鼠禁食12 ～14 h 后，处死动物，眼球取血，分离血清，日本日立7600P 全自动生化分析仪测定血清甘油三酯(triglyceride，TG)、胆固醇(cholesterol，TC)及血肌酐(serum creatinine，SCr)。24 周龄和28 周龄小鼠指标检测方法同上。

4.4 免疫组织化学染色 将石蜡包埋的肾组织制成4 μm 厚的切片，用SABC 法检测肾组织TGF－β1的蛋白表达情况。以PBS 代替Ⅰ抗作为阴性对照。每张切片随机选取6 个高倍视野，每组选取6 张切片，Olympus 公司图像采集系统采集图像，Image－Pro Plus 5.1 图像分析软件进行半定量分析。

4.5 RT－PCR 检测肾组织TGF－β1和BMP－7 mRNA 表达 按照Trizol 说明书提取肾组织总RNA，紫外分光光度计测定总RNA 质量与浓度。每组分别取5 μg 先进行逆转录反应，反应结束后分别取4 μL 反应产物，进行多聚酶链(PCR)反应，TGFβ1、BMP－7 和β－actin 的退火温度均为50 ℃，95℃5 min，95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃40 s，扩增36轮。PCR 产物的电泳分析:取10 μL 产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外灯下根据PCR marker 位置判断目标产物，拍照后进行灰度扫描，分别计算TGF－β1和BMP－7 扩增产物的吸光度值与β－actin 扩增产物的吸光度值的比值作为表达水平参数，进行半定量分析。

5 统计学处理

结 果

1 一般状态及体重变化情况

模型组小鼠有精神不振，活动迟缓，尿量明显增多，体毛缺乏光泽，而且随着周龄增加症状加重。治疗组以上情况得到不同程度的改善。模型组28 周龄小鼠有1 只死亡。模型组小鼠各时点体重均比正常组增长明显，差异显著(P ＜0.01)。治疗组小鼠20、24 周龄体重均比正常组增长明显，差异显著(P＜0.01);与模型组相比，治疗组20 ～28 周小鼠体重增长减缓，差异有统计学意义(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表1。

表1 各组小鼠体重检测结果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

表1 各组小鼠体重检测结果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG. NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 25.68 ±4.49(n=6) 30.17 ±1.94(n=6) 32.83 ±3.66 (n=6)MG 41.42 ±2.53＊＊(n=6) 45.13 ±2.09＊＊(n=6) 43.28 ±3.65＊＊(n=7)TRG 36.47 ±3.23＊＊▲(n=6) 39.93 ±3.31＊＊▲▲(n=6) 35.87 ±4.91▲▲(n=8)

2 血清生化指标检测结果

从20 周龄开始，模型组及治疗组小鼠血糖比正常组高，差异显著(P ＜0.01)，治疗组小鼠空腹血糖较模型组降低，差异显著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表2。模型组SCr 自24 周龄开始明显升高，与正常组相比差异显著(P ＜0.01);治疗组小鼠24 及28 周龄时SCr 水平较模型组明显降低(P ＜0.01)，并且28 周龄时高于正常组(P ＜0.05)，见表2。模型组自20 周龄开始，TG 和TC 明显升高，与正常组小鼠相比差异显著(P ＜0.01);20 和28 周龄时治疗组小鼠TG 较模型组有所降低，24 周龄时，治疗组小鼠TC 较模型组明显降低(P ＜0.01)，见表3。

表2 各组小鼠血糖及血清肌酐检测结果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

表2 各组小鼠血糖及血清肌酐检测结果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group BG(mmol/L)SCr(μmol/L)20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 5.21±0.95 (n=6) 4.25±1.28(n=6) 3.54±1.06(n=6) 10.05±1.13(n=6) 6.21±2.00(n=6) 9.42±2.60(n=6)MG 22.50±2.69＊＊(n=6) 20.85±5.86＊＊(n= 6) 12.54±2.36＊＊(n=7) 9.45±1.41(n=6) 12.08±1.14＊＊(n=6) 19.17±3.38＊＊(n=7)TRG 13.68±3.15＊＊▲▲(n= 6)14.83±3.21＊＊▲(n=6) 7.00±1.51＊＊▲▲(n=8) 10.10±1.12(n=6) 7.70±0.90▲▲(n=6) 13.36±3.07＊▲▲(n=8)

表3 各组小鼠甘油三酯和胆固醇检测结果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

表3 各组小鼠甘油三酯和胆固醇检测结果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group TG TC 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 0.15±0.03(n=6) 0.64±0.06(n=6) 0.65±0.24 (n=6) 2.53±0.23(n=6) 2.04±0.24(n=6) 2.10±0.34(n=6)MG 0.25±0.02＊＊(n=6) 2.20±0.44＊＊(n=6) 1.68±0.60＊＊(n=7) 5.21±1.17＊＊(n=6) 6.48±0.50＊＊(n=6) 6.18±1.73＊＊(n=7)TRG 0.19±0.05▲▲(n=6) 1.79±0.48＊＊(n=6) 1.13±0.48▲(n=8) 5.13±0.85(n=6) 3.86±1.00＊＊▲▲(n=6) 5.43±0.90＊＊(n=8)

3 免疫组化染色结果

正常组肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞胞浆中均有较弱的TGF－β1表达，见图1A;模型组与正常组比较，肾小管上皮细胞胞浆中TGF－β1强阳性表达，肾小球内也可见表达，但不如肾小管上皮细胞胞浆表达明显，且其表达随周龄增长而增多，见图1B。治疗组小鼠TGF－β1在肾小球和肾小管的表达均较模型组明显降低，差异显著(P ＜0.01)，见图1C、表4。

4 RT－PCR 检测TGF－β1和BMP－7 mRNA 的表达

各周龄模型组小鼠肾脏TGF－β1mRNA 表达均比正常组小鼠高，治疗组小鼠TGF－β1mRNA 表达比模型组低，差异显著(P ＜0.05);各周龄模型组小鼠肾脏BMP－7 mRNA 表达均比正常组小鼠低，20和24 周龄治疗组小鼠BMP－7 mRNA 表达比模型组高，差异显著(P ＜0.05)，28 周龄治疗组与模型组无显著差异，见图2、表5。

Figure 1. Expression of TGF－β1 in renal tissues from each group at the end of 24 weeks (immunohistochemical staining， × 400). A:normal group;B:model group;C:treatment group.图1 24 周龄各组小鼠肾组织TGF－β1 免疫组化染色

表4 各组小鼠肾脏TGF－β1 的免疫组化图像分析结果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

表4 各组小鼠肾脏TGF－β1 的免疫组化图像分析结果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 20 475.72 ±5 204.95 21 363.45 ±5 111.88 22 598.90 ±5 381.02 MG 94 385.10 ±16 695.46＊＊ 142 483.97 ±7 149.30＊＊ 192 384.28 ±6 480.86＊＊TRG 28 405.74 ±11 981.22▲▲ 70 242.29 ±7 839.27＊＊▲▲ 63 171.88 ±5 075.73＊＊▲▲

Figure 2. TGF－β1 and BMP－7 mRNA expression in renal tissues from each group at the end of 24 weeks. M:marker;NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.图2 24 周龄各组小鼠肾组织TGF－β1 和BMP－7 mRNA 表达情况

表5 各组小鼠肾脏BMP－7 和TGF－β1 的RT－PCR 图像分析结果Table 5. Image analysis results examined by RT－PCR of BMP－7 and TGF－β1 in the kidney of mice in various group (±s.n=5)

* P ＜0.05 vs NG;▲P ＜0.05 vs MG.

Group BMP－7 TGF－β 1 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 1.57 ±0.09 1.55 ±0.27 1.65 ±0.61 0.33 ±0.05 0.34 ±0.02 0.35 ±0.01 MG 0.84 ±0.26* 0.86 ±0.33* 0.87 ±0.37* 0.53 ±0.05* 0.59 ±0.06* 0.53 ±0.07*TRG 1.11 ±0.47＊▲ 1.23 ±0.20▲ 0.97 ±0.35* 0.37 ±0.03▲ 0.39 ±0.05▲ 0.37 ±0.02▲

讨 论

黄芪注射液为传统中药黄芪提取物的灭菌水溶液(10 mL 相当于生药材20 g)，主要成分为黄芪多糖、黄酮、黄芪皂苷等，具有益气养元，扶正祛邪，养心通脉的功效。临床研究证实黄芪注射液能降糖调脂，改善糖尿病肾病患者的肾功能［1］。葛根素注射液为传统中药葛根提取物的灭菌水溶液，主要成分为葛根素，为由豆科植物野葛干燥根中提出的一种黄酮苷，其亦为临床证明有效的单味中药提取物，实验研究有明显的降血糖作用［2］。我们的实验结果显示，模型组小鼠出现精神不振，活动迟缓，尿量明显增多，体毛缺乏光泽等症状，而且随着周龄增加症状加重。治疗组小鼠以上情况得到不同程度的改善。模型组和治疗组各时点体重均比正常组增长明显，但是与模型组相比，治疗组20 ～28 周小鼠体重增长减缓。糖尿病模型组小鼠血糖、TG、TC 和SCr 较正常组升高，治疗组上述指标仍高于正常组，但较模型组明显下降，尤其是在治疗早期，下降更为明显，提示黄芪注射液联用葛根素注射液有降血糖、降血脂、保护肾功能的作用。

DN 是糖尿病慢性并发症，在糖尿病早期尚无肾功损害时，肾脏内环境及超微结构已经出现改变。DN 早期病理改变为肾小球体积扩大、基底膜增厚、系膜基质增生，晚期为肾小球和肾间质纤维化，病变本质是细胞外基质(ECM)合成与降解失衡，ECM 过度积聚和沉积。其中由肾小管上皮细胞转分化(EMT)而来的肌成纤维细胞(MFB)能合成大量ECM。很多因素参与促进ECM 的沉积，TGF－β1的作用受到广泛关注［3］。TGF－β1在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用，包括:促进ECM 成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原和多种蛋白多糖的合成;抑制ECM 的降解;促进整合素的表达而增强细胞与基质的作用;促进肾小管上皮细胞的转分化等［4－5］。

机体内还存在一种天然拮抗TGF－β1的因子，即BMP－7。它可促进胚胎期肾脏发育过程中间充质细胞向上皮细胞的分化，是胚胎肾脏发育分化及生长不可缺少的重要因子，在成年哺乳动物肾脏中会持续高度表达。Gould 等［6］证实在肾脏损伤修复的过程中，BMP－7 高表达，根据其及其受体在肾脏独特的表达及分布方式推测，它可能具有保护肾脏、防御损伤的作用。现已证实:BMP－7 可以通过影响TGF－β1/Smad 信号通路阻断肾小管上皮细胞转分化进程，发挥抗纤维化作用［7］。DN 动物模型中，肾脏BMP－7 及其受体的表达明显下降，下降幅度与肾纤维化的程度平行［8］，给予外源性BMP－7 治疗能明显延缓DN 的进程，部分逆转肾小球肥大，改善肾功能［9］。

我们的免疫组化结果显示，模型组小鼠与正常组比较，肾小管上皮细胞胞浆中TGF－β1强阳性表达，肾小球内也可见表达，但不如肾小管上皮细胞胞浆表达明显，且其表达随周龄增长而增多。治疗组小鼠肾组织TGF－β1蛋白表达均较模型组明显降低，差异显著。RT－PCR 结果显示，模型组小鼠肾脏TGF－β1mRNA 表达比正常组小鼠高，治疗组小鼠TGF－β1mRNA 表达比模型组表达降低;模型组小鼠肾脏BMP－7 mRNA 表达比正常组小鼠低，20周龄和24 周龄治疗组小鼠BMP－7 mRNA 表达比模型组高。这表明黄芪注射液联合葛根素注射液对2型糖尿病肾病模型KKAy小鼠的肾脏保护作用可能是部分通过抑制DN 肾脏中TGF－β1的表达，并通过增加肾脏组织BMP－7 的表达从而拮抗TGF－ β1的致纤维化作用来实现的。本研究为黄芪注射液联用葛根素注射液治疗DN 提供了实验依据。

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［8］ Wang SN，Lapage J，Hirschberg R. Loss of tubular bone morphogenetic protein－7 in diabetic nephropathy［J］. J Am Soc Nephrol，2001，12(11):2392－2399.

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