多发性骨髓瘤细胞形态分型与流式细胞术检测抗原表达相关性研究

杨佳 杨波 张丽 黄艳 孙嘉峰

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以骨髓中单克隆性浆细胞增生异常和集聚为特征的恶性肿瘤，多见于中老年人，约占造血系统肿瘤的10﹪[1]，经典的MM诊断包括组织活检、骨髓涂片检查、X线检测和单克隆免疫球蛋白测定等联合方法，而没有MM细胞表面相关抗原检测。本研究应用流式细胞术检测MM细胞表面相关抗原，以形态学诊断分型为基础，探讨两种诊断方法的相关性，旨在为本病的诊断、治疗及预后探索更有价值的方法。

对象与方法

一、对象

收集山西医科大学第二临床医学院2009年01月至2011年12月门诊及住院的28例MM患者临床资料，诊断依据张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》[2]。其中男18例，女10例，男∶女=1.8∶1，中位年龄61岁（24～82岁）。依据血清免疫固定电泳检查结果：IgG型12例，IgA型5例，轻链型4例，未分泌型4例，3例未分型。28例患者均行骨髓穿刺（bone marrow aspiration，BMA）及流式细胞术（ flow cytometry，FCM）检测。

二、方法

1.流式细胞分析：取患者新鲜骨髓液3ml，EDTA-K2抗凝。用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司FC500型）通过CD45/SSC配合CD38+/CD138+设门设定待检细胞群，分析该细胞群的抗原表达情况，检测使用单抗包括CD138、CD38、CD56、CD19。检测结果以抗原表达> 20﹪为阳性。

2.骨髓涂片检测：患者BMA液涂片，室温晾干，运用瑞氏-姬姆萨（Wright- Giemsa's）混合染液，染色15min，水洗晾干后镜检,在涂片佳、染色良好、细胞分布均匀处，分类计数200个有核细胞，计算出骨髓瘤细胞的百分比。依据Greipp分型标准[3-4]，对骨髓瘤细胞进行形态分型。

3.观察指标：所有病例确诊时的年龄、性别、临床表现、M蛋白分型、血红蛋白、骨髓浆细胞总数、白蛋白（albumin，ALB）、血清钙浓度(Calcium，CA)、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，CR）、β2微球蛋白和C反应蛋白（C-Reactive protein，CRP）等各项结果逐一记录进行回顾分析。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件处理，流式抗原表达阳性数、骨髓细胞形态分型结果用相对数表示，其组间差异用卡方检验和秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、流式细胞分析结果

28例MM患者应用CD45/SSC配合CD38+/CD138+设门证实可疑瘤细胞比例为4.0﹪～75.4﹪。其中25例CD38（89.3﹪）表达阳性，阳性表达率均值为88.92﹪；15例患者CD56(53.6﹪)表达阳性，阳性表达率均值为68.72﹪，13例（46.4﹪）MM患者CD56不表达；CD19仅2例（7.1﹪）阳性表达；22例MM患者检测CD138抗原，其中21例（95.5﹪）阳性表达，阳性表达率均值为69.57﹪（表1）。除CD38与CD138外，各组间差异均有统计学意义（c2=54.343，P=0.000）。

二、MM细胞态学分型

将每例患者骨髓有核细胞增生程度按低下、活跃、明显活跃和极度活跃划分，分别为4例、9例、13例和2例，骨髓浆细胞比例≥30﹪的患者15例，< 30﹪患者13例。依据Greipp标准分型[3-4]，28例MM患者中，幼稚浆细胞型6例、中间浆细胞型5例、成熟浆细胞型17例。

三、抗原表达与形态学分型的关系

本组研究28例MM患者，形态学检查骨髓瘤细胞比例在为8.0﹪～83.5﹪，流式细胞分析应用CD45/SSC配合CD38+/CD138+设门证实可疑瘤细胞比例为4.0﹪～75.4﹪，对28例MM患者骨髓涂片浆细胞比例及流式细胞分析检测的异常细胞群所占比例进行分析，显示骨髓瘤患者骨髓涂片浆细胞比例与流式细胞分析测定的异常细胞群比例之间存在差异（配对资料的秩和检验，Z=-4.202，P < 0.001）；且流式细胞分析的可疑瘤细胞比例低于骨髓形态计数分析的骨髓瘤细胞比例。本组研究中，将成熟和中间型骨髓瘤患者划为一组，幼稚型骨髓瘤患者为另一分析组，发现以幼稚型浆细胞为主的MM患者比成熟和中间型为主的患者更容易见到CD56阳性表达（c2=4.456，P=0.035）。但 CD56是否表达与骨髓涂片浆细胞比例高低差异无统计学意义(c2=0.001，P=0.978，表 2）。

表1 28例MM患者流式相关抗原表达情况

四、CD抗原与实验室检测指标的关系

分析研究28例患者中，CD45、CD138、CD38、CD56、CD19是否表达与临床实验室检测指标（ALB、CA、BUN、CR、β2微球蛋白、CRP）改变差异无统计学意义(P > 0.05)。

讨 论

CD138、CD38被认为是特异性的浆细胞表面标记，骨髓瘤细胞表面CD45不表达或弱表达，大部分骨髓瘤细胞表面有CD56高表达。CD19表达于正常浆细胞，而MM细胞不表达。流式细胞术免疫分型经典方法CD45/SSC设门，检测结果存在多种影响因素。本试验通过CD45/SSC结合CD38+和CD138+设门来识别、分选骨髓瘤细胞，进行抗原检测，并结合形态学、临床情况等，分析其相互关系。

Garcia等[5]报道CD138表达率在MM可达到100﹪，CD38在骨髓瘤细胞强表达可以作为骨髓瘤筛选和纯化标志。本组病例检测，CD138阳性表达21/22例（95.5﹪），阳性率均值为69.57﹪；CD38阳性表达25/28例（89.3﹪），阳性率均值为88.92﹪。与文献报道基本一致。

CD56在正常成熟浆细胞上几乎不表达,但在MM细胞中表达率较高，CD56阴性不能排除骨髓瘤细胞。Seeqmiller等[6]发现CD56的高表达与疾病的侵袭性有关。但Sahara等[7]认为CD56+的MM患者预后较好。CD56-患者往往伴有β2微球蛋白高和血小板计数低下容易出现本周蛋白阳性、肾功能不全及髓外浸润等特点。本组研究显示，15/28例(53.6﹪)患者CD56表达阳性，13/28例（46.4﹪）MM患者CD56不表达。其中，6例幼稚型浆细胞为主的MM患者均显示CD56阳性表达，发现以幼稚型浆细胞为主的MM患者比成熟和中间型为主的患者更容易见到CD56阳性表达。结合文献与本组研究结果笔者认为，CD56在MM的诊断、治疗及预后中的确有着重要的意义，但由于病例资料有限，其确切意义需进一步研究与完善。

本组研究显示，FCM测定的可疑瘤细胞比例与骨髓形态计数分析的骨髓瘤细胞比例差异的原因：（1）虽然FCM检测使用的是单细胞悬液，有较好的均一性，分析细胞的数量大，有较高的检出率，但该设门方法骨髓瘤细胞与有核红细胞根据侧向散射角（Side Scatter，SSC）值仅能作粗略区分，在骨髓瘤细胞比例低时易受有核红细胞的影响，误将其认为骨髓瘤细胞；（2）在FCM分析中需要破除成熟红细胞，由于浆细胞胞浆量丰富，破红过程中会造成少量浆细胞破坏，致使FCM检测的浆细胞比例减低；（3）骨髓涂片会因各种影响因素会造成细胞分布的不均匀，以致不同计数区域骨髓瘤细胞的比例差异较大。

FCM检测骨髓瘤相关抗原表达情况不仅可以在部分疾病（如反应性浆细胞增多症、巨球蛋白血症等）骨髓形态表现与MM相近时协助诊断，还可以从骨髓瘤的复发、髓外浸润等多个方面来对MM患者的预后进行全面评估，但部分抗原在预后中的意义，尚存在争议。因此，更需要结合多方面指标评价其对骨髓瘤预后的影响。骨髓涂片形态学检查，可以从肿瘤负荷，细胞分化程度来揭示其对预后的意义。在临床工作中，通过流式分析技术与骨髓形态综合分析，可以提高判断的准确性，减少漏诊和误诊。

表2 28例MM患者CD56与骨髓涂片相关检查的分析

1 陶中飞,傅卫军,陈玉宝,等.206例多发性骨髓瘤预后因素分析及分期评价.癌症,2006,25(4)：461-464.

2 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].2版.北京：科学出版社,1998：373-380.

3 Greipp PR,Raymond NM,Kyle RA,et al.Mutiple myeloma:Significance of plasmablastic subtype in morphological classification[J].Blood,1985,65(2):305-310.

4 Greipp PR,Leong T,Bennett JM,et al.Plasmablasticmorphology: An independent prognostic factor with clinical and laboratory correlates—Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) myeloma trial E9486 report by the ECOG Myeloma Laboratory Group[J].Blood,1998,91(7):2501-2507.

5 Garcia-SanzR,Orfao A,GonzalezM,et al.Primary plasma cell leukemia: clinical immunophenotypic,DNA ploidy and cytogenetic characteristics[J].Blood,1999，93(3):1032-1037.

6 Seeqmiller AC，Xu Y，McKenna RW，et al.Immunophenotypic differentiation between neoplastic plasma cells in mature B-Cell lymphoma vs plasma cell myeloma[J].Am J Clin Pathol，2007，127( 2): 176-181.

7 Sahara N，Takeshita A.Prognostic significance of surface markers expressed in multiple myeloma：CD56 and other antigens[J].Leuk Lymphoma，2004，45(1)：61-65.