体外预处理对猪胰岛细胞免疫原性的影响

董维平 王煜非 彭永德

大量实验研究证明，胰岛移植不仅能纠正糖尿病动物的代谢异常，还能防止微血管病变，是治疗1型糖尿病的理想方法[1]。胰岛移植手术简便安全，但由于存在免疫性排斥，胰岛移植常需使用大量免疫抑制药物，从而限制了临床应用。如果能够通过对胰岛细胞的预处理，降低移植物的免疫原性，将有助于胰岛细胞的存活，并减少免疫抑制药物的应用，有利于胰岛移植的临床推广。本研究采用24℃培养、冷冻保存、中波紫外线照射和抗主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类抗原单克隆抗体等方法对胰岛进行预处理。以胰岛-淋巴细胞混合培养(mixed islet lymphocyte culture,MILC)、抗猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）-DR单抗免疫组化染色阳性细胞和淋巴细胞数量比较各组胰岛的免疫原性，以胰岛素释放试验比较胰岛的功能，比较各种体外预处理对胰岛细胞免疫原性和功能的影响，选择既能降低胰岛细胞的免疫原性，又不影响胰岛功能的预处理方法。

材料与方法

一、仪器与材料

选用1～3日龄杂种猪作为实验动物。准分子激光仪为波长308 nm，20 mj/脉冲 （中科院上海光机所准分子激光研究室研制）。

胶原酶P(瑞士Roche公司)，新生牛血清（newborn calf serum,NCS）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI 1640培养液（美国GIBCO公司），抗MHCⅡ类抗原单抗(美国VMRD公司)，SLA-DR单抗(美国Pharmingen公司)，ABC免疫组化试剂盒(美国Vector公司)。

二、方法

（一）胶原酶溶液的配制

于100ml Hank液中加入固体氯化钙82.5 mg (7.5mmol/L)，HEPES 238 mg(10mmol/L)，完全溶解后用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到7.8，加50 mg胶原酶P，完全溶解后以0.2 μm孔径的针头滤器过滤除菌。

（二）胰岛细胞制备

新生猪经消毒后，剖腹取胰，于冷Hank液中剪碎(< 1mm3)，加冷 Hank 液 50ml，4℃，200×g离心2min，弃上清液，每立方厘米胰腺碎片加胶原酶溶液10ml，于38℃水浴振荡消化8min，吸取上层已分离的细胞悬液，沉淀加胶原酶液再消化8min，用吸管吹打后加含10﹪NCS的冷Hank液终止消化，4℃，200×g离心 2min，弃上清液，用Hank液洗涤2次，加含20﹪FBS的RPMI 1640培养液培养。

（三）分组

A组（24℃组）：于含20﹪FBS的RPMI 1640培养液，5﹪CO2培养箱24℃培养5 d。B组（冻存组）：胰岛细胞于5﹪CO2培养箱37℃培养2 d，收集胰岛样细胞团(islet-like cell cluters,ICCs)于2ml冻存管，加含10﹪DMSO、20﹪FBS的RPMI 1640培养液，4℃平衡30min，以0.3℃/min速率降温到-80℃，投入液氮中，保存2 d后38℃恒温水浴解冻，冷Hank液倍比稀释透出DMSO，冷Hank液洗涤，加含20﹪FBS的1640培养2 d。C组（激光组）：将培养2 d的ICCs混悬于1640培养液，置5.5 mm培养皿中，中波(308 nm)准分子激光，20 mj/脉冲，1200次，37℃再培养2 d。D组（抗体组）：于培养2 d的ICCs培养液中加抗MHCⅡ类抗原单抗(0.5﹪终浓度)，37℃孵育2 d。E组（对照组）：5﹪CO2培养箱37℃培养5 d 。

（四）免疫原性检测

1.胰岛-淋巴细胞混合培养(MILC)：Wistar大鼠心内穿刺采血10ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，置1640培养液，调整细胞至1×106/ml，加入96孔U型底培养板，每孔0.1ml，另分别加各组ICCs 10个/ 0.1ml，每份样品3个复孔；同时作单纯淋巴细胞培养(空白对照)。37℃培养 4 d 后，各孔加 3H-Tdr 1 μCi，再培养 18h，收集细胞于玻璃纤维滤膜上，加液态闪烁体后测cpm值(美国Beckman公司3800型液闪测定仪)。取3个复本的中位数，按下述公式计算刺激指数(stimulating index,SI)：SI=各实验组cpm /空白对照cpm。

2.胰岛细胞内MHCⅡ类抗原细胞检测：各组ICCs经OCT包埋，冰冻切片，用抗SLA-DR单抗免疫组化染色(ABC法)，苏木素复染，计数有核阳性细胞数，每个样本计数4个高倍视野，以阳性细胞的平均百分率(﹪)表示。

3.胰岛内淋巴样细胞计数：各组ICCs经OCT包埋，冰冻切片，HE染色，每个样本计数4个高倍视野内淋巴样细胞数，以平均每个高倍视野的淋巴样细胞数表示。

（五）胰岛功能检查

以胰岛素释放试验比较胰岛的功能，收集各组ICCs，离心沉淀，Hank液洗2次，计数，取250个ICCs，各加Hank液1ml(含2.8mmol/L葡萄糖)，37℃培养2h，吸取上清液送测胰岛素。再加高糖Hank液1ml(含16.7mmol/L葡萄糖，10mmol/L茶碱)，37℃培养2h，吸取上清液送测胰岛素。以胰岛素释放指数(高糖胰岛素释放量/低糖胰岛素释放量)作为胰岛细胞功能鉴定的指标。

(六)统计学分析

所有数据使用SPSS 10.0统计软件处理，胰岛细胞免疫原性检测指数（SI刺激指数,DR+细胞数、淋巴样细胞数）及胰岛素释放结果及释放指数以表示 ；以上指标 A、B、C、D、对照组间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MILC

预处理各组ICCs的SI值分别为2.2±0.8、1.8±0.6、2.0±1.5、2.1±1.0 和7.4±2.3，各组与对照组比较，差异有统计学意义(F=30.398，P=0.01，表 1)。

二、胰岛内SLA-DR阳性细胞检测

预处理各组的ICCs中SLA-DR阳性细胞数分别为2.9﹪±0.4﹪、2.3﹪±0.8﹪、2.4﹪±0.3﹪、2.0﹪±0.8﹪和12.5﹪±5.9﹪，各组与对照组比较，差异有统计学意义(F=103.154,P=0.01，表1)。

三、胰岛内淋巴样细胞计数

预处理各组ICCs内的淋巴样细胞数分别为 29.0±4.1、27.0±4.0、28.0±2.8、2.6±4.0 和111.0±14.0，各组与对照组比较，差异有统计学意义 (F=276.212,P=0.01,表 1)。

表1 胰岛细胞免疫原性检测结果( )

表1 胰岛细胞免疫原性检测结果( )

注：MILC为胰岛-淋巴细胞混合培养

鰈别动物数MILC （SI）DR+ 细胞数（﹪）淋巴样细胞数/视野A组 10 2.2±0.8 2.9±0.4 29.0± 4.1 B组 10 1.8±0.6 2.3±0.8 27.0± 4.0 C组 10 2.0±1.5 2.4±0.3 28.0± 2.8 D组 10 2.1±1.0 2.0±0.8 26.0± 4.0对照组 10 7.4±2.3 12.5±2.9 111.0±14.0 F值 30.398 103.154 276.212 P值 0.000 0.000 0.000

四、胰岛素释放试验

经预处理的ICCs与对照组的胰岛素释放试验结果，高糖浓度下各组分别为（832±157），（592±126），（783±109），（872±105），（773±141）pmol/L，差异有统计学意义（F=6.918，P=0.000），而低糖组和释放指数，各组差异无统计学意义(F=0.629，P=0.644 ；F=0.686，P=0.991，表 2)。

讨 论

胰岛移植的排斥反应是依赖供体的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)或过路白细胞(passenger leukocytes)触发的[2]。存在于APC如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells，DC)等细胞表面的MHCⅡ类分子激活宿主CD4阳性细胞，是胰岛移植后免疫排斥的主要途径[3]。移植物的免疫原性依赖MHC抗原表达、黏附分子和所谓的过路白细胞的数量[4]。如果能够减少或清除这些APC，可减少或防止移植物排斥。据文献报道，大鼠的胰岛细胞本身为Ia阴性，若在移植前除去移植胰岛中夹杂的Ia阳性细胞，则可有效地延长移植胰岛的存活时间[5]。

Lacy等[6]曾报道24℃培养能降低胰岛的免疫原性，本研究24℃培养组（A组）MILC的SI较对照组（E组）明显减少。以往对啮齿类动物胰岛的研究发现[7-10]，冻存后胰岛的免疫原性减低，MHCⅡ类抗原或携带Ia抗原的阳性细胞减少，而胰岛的内分泌功能未见明显改变。冻存组（B组）的SI明显低于对照组。据文献报道，中波紫外线能抑制人或动物外周血淋巴细胞增殖[11-14]。由于紫外灯都是连续波长，本研究采用了单一波长（308 nm）的准分子中波紫外激光仪定量照射。经过24 J能量照射后的猪胰岛（C组）MILC的SI明显低于对照组差异有统计学意义。Steinman等[13]曾用抗MHCⅡ类单克隆抗体或DC特异性单克隆抗体预处理胰岛及甲状腺组织去除DC，同种移植后可长期存活。本研究应用抗MHCⅡ类抗原单抗对胰岛细胞进行体外预处理，结果预处理组（D组）ICCs的MILC刺激指数明显低于对照组。本组资料采用24℃培养、冷冻保存、紫外线照射和抗体预处理方法，均能够降低胰岛细胞对异种淋巴细胞的刺激作用，表明这些预处理方法能够降低胰岛细胞的免疫原性，与文献报道的结果相同。

Miyamoto等[14]认为人胰岛冻存后免疫原性降低可能与胰岛内APC丧失或功能减低有关，MHCⅡ类抗原阳性细胞如血管内皮细胞、导管上皮细胞等亦明显减少。本研究用抗MHCⅡ类抗原单抗预处理胰岛细胞，选择抗SLA-DR单抗的免疫组化来检测胰岛中MHCⅡ类抗原阳性细胞。结果显示24℃组、冻存组、激光组和抗体组的胰岛中SLA-DR阳性细胞数较对照组明显减少，淋巴样细胞亦明显少于对照组。本组资料结果亦证实胰岛内抗原提呈细胞的数量与胰岛的免疫原性相关。

各种预处理对胰岛细胞功能的潜在不利影响一直受到关注。Faustman等[5]认为大鼠的胰岛细胞是MHC-Ia阴性，除去移植胰岛中夹杂的MHC-Ia阳性细胞不影响胰岛细胞的活性。本组资料中，预处理各组的低糖胰岛素含量、高糖胰岛素含量和胰岛素释放指数与对照组比较，差异均无统计学意义。提示24℃培养、冷冻保存、中波紫外激光照射和抗MHCⅡ类抗原单抗对胰岛细胞的无明显影响。

表2 胰岛素释放试验结果( )

表2 胰岛素释放试验结果( )

组别 动物数 低糖（pmol/L） 高糖（pmol/L） 胰岛素释放指数A组 10 219± 65 832±157 3.8±2.7 B组 10 171± 53 592±126 3.5±1.6 C组 10 207± 85 783±109 3.8±2.4 D组 10 213±102 872±105 4.1±3.2对照组 10 199± 57 773±141 3.9±2.9 F值 0.629 6.918 0.686 P值 0.644 0.000 0.991

本组资料结果表明，胰岛细胞经抗短期24℃培养、冷冻保存、中波紫外线激光照射和抗MHCⅡ类抗原单抗预处理，能明显降低其免疫原性，同时对胰岛功能无明显影响。

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