临床成人胰岛细胞制备技术规范

黄梁浒 陈津 王庆华 马予洁 谭建明

前言

根据中华人民共和国卫生部医疗服务标准专业委员会制定的基本原则，结合《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《药物临床试验质量管理规范》、《医疗废物管理条例》、《消毒管理办法》、《临床实验室废物处理原则》等规范性文件，制定《成人胰岛分离、纯化、培养、移植前制备技术规范》，简称临床成人胰岛细胞制备技术规范[1-2]。

一、范围

本项技术规范规定了成人胰腺器官的接收、胰腺修剪、胰岛消化、胰岛纯化、胰岛计数、胰岛培养、胰岛移植前制备以及以上一系列操作过程的质量控制等要求。

本项技术规范适用于在GMP层流实验室条件下成人胰岛的分离、纯化、培养与移植前制备，以及该过程中所涉及的质量控制。本项技术规范不适用于婴幼儿、其他物种的胰岛分离纯化等实验。

二、规范性引用文件

下列文件对于本规范的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注明日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，《药物临床试验质量管理规范》，《医疗废物管理条例》，《消毒管理办法》，《临床实验室废物处理原则》。

三、术语和定义（下列术语和定义适用于本文件）

1.胰岛分离（islet isolation）应用胶原酶和机械作用力，将胰岛从胰腺腺泡细胞包裹状态中快速分离出来的过程。

2.胰岛纯化（islet purification）胰腺经胶原酶和机械作用力作用后，其产物为胰岛和腺泡细胞混合物，无法达到胰岛移植的要求。通过一定大小的离心力作用后，按直径大小不同，将叠加在淋巴细胞分离液（ficoll分离液）上方的胰岛和腺泡细胞（连续或不连续密度梯度），分布在不同密度的分离液中，分段收集，从而得到纯度较高的胰岛。

3.胰岛计数（islet enumberation）在标尺显微镜下，将经双硫脘染色后的胰岛，按直径（51～100、101～150、151～200、201～250、251～300、301～350、351～400、> 400 μm）大小进行分类计数，并将乘以相应系数的各个直径范围胰岛数目求和，从而得到该分离胰腺的胰岛当量。

4.胰岛纯度（islet purity）胰岛计数后，根据胰岛直径大小估算胰岛细胞数目，并计数显微镜下胰腺腺泡细胞的数目，计算胰岛细胞在所有细胞的百分比。

四、缩略语

1.IEQ ：islet equivalent，胰岛当量。

2.HSA ：human serum albumin，人血清白蛋白。

3.UWS ：university of wisconsin solution，威斯康星大学溶液。

4.BSC ：bio-safety cabinet，生物安全柜。

5.GMP ：goods manufacturing practice，药 品生产质量管理规范。

6.CO2：carbon dioxide，二氧化碳。

7.HBV ：hepatitis B virus，乙型肝炎病毒。

8.HCV ：hepatitis C virus，乙型肝炎病毒。

9.HIV ：human immunodeficiency virus，人类免疫缺陷病毒。

10.CMV ：cytomegalo virus，巨细胞病毒。

技术规范

一、胰岛细胞制备的实验室条件

（一）一般要求

1.所有与胰岛分离相关的仪器设备应做周保养、月保养，并记录。

2.所有用数字显示相关数据的仪器，如冷库、离心机、冰箱、天平、移液器、恒温水育箱、消化罐温度探针等，首次使用前均需经计量检测部门检测合格后方可使用，定期检测并记录。

3.所有仪器每次使用后应及时消毒保养处理。

4.所有与胰岛分离相关的仪器设备应有操作使用说明，应制定并张贴出仪器运行的合理范围，当仪器出现故障、应急情况时应有相应处理方案。

（二）层流净化

1.若是新建层流净化，必须经省级以上具有相应资质的单位检测合格后，方可正常使用。每两年应进行一次净化功能检测，由省级以上单位实施，并出具检测报告。

2.层流净化的设计工艺应为正压向下式，其中高效过滤网应每两年更换一次。进风口应位于上风口，进风口的中效过滤网应每半年更换一次，初效过滤网视环境的洁净程度而定，更换周期不能超过三个月。出风口应位于进风口风向的下游。

3.层流净化的等级应≤十万级，其中实验区域，包括操作间、细胞培养间、冷库（4℃）、离心区域等应在万级以下。

4.层流净化的人流、物流通道应分离，不得使用同一条通道。所有通道均应为单向走向，不得回头。在不同等级的净化区域之间应设立缓冲区。

5.应定期检查并登记层流净化的温湿度。

（三）离心机

应定期清洁，并定期校验离心机的离心速度。定期检查和添加离心机轴的润滑油。

（四）二氧化碳（CO2）培养箱

1.应定期清洗并检查培养箱，每个工作日检查指示的培养箱内温度和CO2浓度。应注明最高与最低温度控制，应制定并张贴出仪器运行的合理范围，当读数超过合理范围时应有相应处理方案。每周检查贮气瓶气体至少1次。

2.至少应建立两个独立的培养系统，其中1个温度为37℃，另一个温度为22℃。

（五）4℃冷库

胰岛制备实验室应具备1个6 m2左右大小的冷库，其温度范围应在2～8℃。若是首次使用，应在打开冷库后，至少平衡24 h方可使用。

（六）细胞淘洗仪（COBE仪）

一个标准胰岛制备实验室应具备2台或以上的COBE仪。COBE仪应摆放于4℃冷库，保证整个胰岛纯化过程始终处于低温状态。

（七）生物安全柜（BSC）

应定期作日、周、月保养。并定期检测和更换过滤网的功效。定期更换安全柜内的紫外线消毒灯管。

（八）冰箱

1.4℃冰箱 每台冰箱应放置至少1个温度计，应每日观察并记录冰箱温度。

2.-20℃冰箱 应每日观察并记录冰箱温度，并定期检测。定期或不定期检查冰箱的结霜程度，并清除之。

3.超低温冰箱 应每日观察并记录冰箱温度。定期清洁冰箱滤网。

二、临床用成人胰岛细胞的制备

（一）供体器官的接收登记

收到供体胰腺器官后，应立即核对供体姓名、性别、年龄、ABO血型是否与申请单一致，核对供体的病原学检查结果是否全部正常，包括肝功、乙型肝炎病毒（HBV）、乙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、巨细胞病毒（CMV）抗体、梅毒螺旋体检测。若信息完全一致，则给予一个胰腺分离的惟一编号（实验室内部的编号系统），并在接收登记本和相关表格上登记；若发现有不一致时，应立即与临床医师取得联系，再一次核对相关信息，确认完全一致后，进行编号、登记，否则应作退回处理。

（二）试剂配制

1.所有试剂的配制应在BSC内完成，同时应注明配制人姓名、配制日期和配制试剂的名称或缩写。完成试剂配制后，应立即贴上相应的标签。

2.所有试剂应在胰岛分离程序前2～3 h内完成，由于整个程序所用到的试剂较多，应按照完成一种试剂配制，立即进行相关登记，然后再开始另一种试剂配制的顺序进行。

3.每次配制完毕，要重新检查和记录每种试剂的数量。应在记录表上注明每种试剂的厂家、批号和有效期，以备查询。配制后的试剂一旦打开，只能在4℃下保存24 h。

4.所有试剂中，除了双硫腙染液、移植时应用的CMRL 1066培养液外，其它试剂均应存放于4℃环境。

（三）胰岛分离、纯化、培养、移植前制备

1.一般要求

从胰腺修剪、清洗、消毒，到最后完成培养、移植前制备，所有操作应在层流条件下BSC内进行，从胰腺保存至胰岛培养前，所有操作应在冰水浴或4℃下进行。

2.胰腺修剪

在开始修剪胰腺前，应先完成标本取样，送检进行细菌革兰染色镜检、细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测等。腺体应用钝性器械分离，完全去除脂肪组织、血管、其他结缔组织，但胰腺外膜保持完整。

3.胰腺消毒清洗

应严格控制在聚维酮碘液消毒时间，以免胰腺沾染上较多的碘液。当发现腺体沾染较多碘液时，应增加洗涤次数。

4.胰腺插管和灌注：（1）插管针应选用16G或18G，过小易造成泄漏，过大则造成胰腺机械性损伤；（2）酶液灌注一定要充分膨胀。若胰腺出现渗漏，用无菌止血钳止漏。若发现胰腺的某些部位膨胀不充分，用18G或20G的针头直接对这些区域进行组织内注射。（3）胰腺应切成大小均匀一致的7～9块。

5.胰腺消化：（1）消化终点的判定十分重要，这关系到胰岛分离的成功与否，应对消化混合物多加观察。当观察到消化终点时，应立即中止消化开始稀释过程；（2）间隔2min应取样一次；（3）振摇消化罐的频率应先慢后快，振摇力度应控制在刚好将组织摇起。

6.胰岛收集离心：（1）收集过程应多人配合，动作快速不混乱；（2）每个离心管的胰岛组织应至少离心洗涤3次；（3）洗涤完毕，应根据纯化方法的不同加入不同的试剂重悬胰岛混合物。

7.胰岛纯化：（1）应严格按照操作程序安装COBE袋，加入150ml Ficoll液后，应注意排气；（2）在叠加Ficoll分离液和组织混合液时，应按顺序叠加；（3）离心后，应分段收集纯化后胰岛。

8.胰岛计数：（1）应配备带标尺的显微镜，物镜应至少具有4×、10×两种镜头；（2）由于胰岛细胞团易发生沉淀，取样前必须彻底混悬胰岛，使取样具有代表性；（3）直径≥50 μm的胰岛才列入计数范围，根据下表进行计数，并根据转换系数和稀释倍数计算胰岛当量（IEQ）：IEQ=稀释倍数×[(直径50～100 μm的胰岛数平均值÷ 6)+(直径 101～150 μm 的 胰 岛 数 平 均 值 ÷ 1.5)+(直径151～200 μm的胰岛数平均值×1.7 )+(直径201～250 μm的胰岛数平均值×3.5 )+（直径251～300 μm的胰岛数平均值×6.3 )+(直径301～350 μm的胰岛数平均值×10.4)+(直径351～400 μm的胰岛数平均值×15.8)+(直径为> 400 μm的胰岛数平均值×22.7)]；（4）根据细胞显色不同（胰岛细胞呈鲜红色、腺泡细胞为棕色），显微镜下估算胰岛纯度，即胰岛细胞占所有细胞数量的百分比。

表1 胰岛直径、平均体积、转换系数对应表

9.胰岛培养：（1）在37℃的培养时间不得超过24 h。（2）应使用防止胰岛贴壁黏附的培养瓶；应按照20000 IEQ/175 cm2培养瓶计算所需培养瓶。（3）使用不含酚红的0.5﹪HSA-CMRL 1066培养液。

10.胰岛移植前制备：（1）移植前应详细核对供者、受者相关信息，准确无误后方可进入移植程序。（2）详细核对胰岛的革兰染色、细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测结果；尚无检测报告的，应立即和相关科室沟通，了解培养进展程度，根据实验室检测的初步结果判断是否进入移植程序。（3）确定可以进行移植后，观察并初步判断胰岛生长情况，联系临床小组，确定是否可以移植。（4）胰岛收集应小心操作，尽可能减少离心次数。（5）及时采样送检进行细菌革兰染色镜检、内毒素检测、细菌培养、真菌培养、支原体检测。待革兰染色镜检和内毒素检测结果为阴性时，方可送达手术室进行临床移植。

11.临床移植用胰岛标准：（1）胰岛细胞活性：即细胞膜的完整性，合格的胰岛制品其活性应≥70﹪。（2）胰岛细胞纯度：合格制品的纯度应≥30﹪。（3）胰岛得率：数量达到≥6000 IEQ/kg受者体重。（4）细菌革兰染色：阴性，即显微镜未检出细菌真菌。（5）内毒素检测：合格的胰岛制品是其体积与受者体重之比应≤5 EU/kg。（6）细菌培养：阴性，即胰岛制品在血琼脂平板上培养3 d均未见细菌生长。（7）真菌培养：阴性，即胰岛制品在沙堡劳琼脂平板上培养7 d均未见菌落生长。（8）支原体检测：包括支原体培养和DNA检测，合格的胰岛制品均为阴性。培养结果阴性表示胰岛制品在支原体专用培养液中培养21d均未见生长，DNA检测阴性表示未检测出。（9）胰岛素刺激指数：分离纯化后的胰岛，经高、低两种浓度的葡萄糖刺激后，其胰岛素含量的比值，即为胰岛素刺激指数。合格的胰岛制剂应在3.0以上。

1 边旭明，朱宝生，刘俊涛，等.胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准.第1部分：中孕期母血清学产前筛查[J/CD].中国产前诊断杂志（电子版）.2011,3(3)：42-47.

2 边旭明，朱宝生，刘俊涛，等.胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准.第2部分：胎儿染色体异常的细胞遗传学产前诊断技术标准[J/CD].中国产前诊断杂志（电子版）.2011,3(4)：46-59.

附录A

（资料性附录）

成人胰岛细胞分离、纯化、培养及移植前制备流程图附录B

（资料性附录）

成人胰岛细胞分离、纯化、培养及移植前制备操作程序

一、胰腺的修剪、清洗和插管

（一）胰腺的修剪

1.在BSC内，应用无菌技术打开装有胰腺的运送罐，取样送检进行细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测、革兰染色镜检等。

2.在含有Eurocollins液（3.57﹪葡萄糖液）的冰水浴方盘中，观察并记录胰腺的外观，包括脂肪量的多少、水肿、充血、软硬程度等，是否附有十二指肠和(或)脾脏，胰腺是否有损伤。应使用器械钝性分离胰腺，小心去除胰腺上的结缔组织和脂肪，以免损伤胰腺，破坏胰腺外膜的完整性，导致在扩张过程中出现渗漏。

（二）胰腺的清洗

1.将胰腺分别经1﹪聚维酮碘-Hanks液、抗生素液消毒，并用1×HBSS清洗3次，期间更换烧杯。

2.将胰腺放入不锈钢运送罐内，称重并记录。将胰腺移至盛有威斯康星大学溶液（UWS）的冰水浴方盘中，称重空的不锈钢运送罐及烧杯并记录。

3.胰腺的插管：用手术刀从头体结合部将胰腺切成两部分，分别从胰总管插入静脉留置管（16G或18G），用线固定后，取出内芯。

二、胰腺的灌注

1.将胰腺移至另一洁净冰水浴方盘中，加入新鲜配制的Liberase-Hank液350ml。用50ml注射器吸取酶液，向胰腺内注入酶液。

2.灌注结束后，清除并称量剔除的组织、缝线和套管等非胰腺组织，计算消化过程中胰腺的真实重量并记录。

3.用手术刀将胰腺切成7～9块，放入Recordi消化罐中，放入弹珠，并加入剩余酶液，直到液面到达放置滤网的平面处。放置滤网，盖上盖子，拧紧螺丝，确保密封没有漏液。

4.取一个250ml离心管，加入100～150ml的Hank液。

三、胰腺的消化

1.打开蠕动泵，流速调整为150ml/min，将剩余的酶液泵入循环回路中，再将250ml离心管中的Hank液泵入循环回路，让Hank液完全充满循环回路，并排除其中的气泡。

2.确定循环回路没有渗漏后，装好温度监控探针，将加热弯管放入45℃水浴箱中，并观察和记录此时消化罐内的温度。

3.振荡消化罐，开始计时。根据胰腺大小、时间和温度调整振荡的力度、频率，开始时速度可适当缓慢，并随时观察罐内温度。当温度达到37℃时，将加热弯管取出，放入37℃水浴箱，并记录时间。

4.消化一定时间后，取样，加入双硫腙染液，在显微镜下观察判断消化进程。此后每间隔2min取样一次，记录所有观察结果。

5.当观察到消化终点时，立即中止消化开始稀释过程，并记录消化过程中时间、温度和观察结果。

四、稀释、收集消化产物

1.在消化的同时，准备稀释过程所需的试剂和收集容器。用250ml离心管收集消化产物，并预先加入适量RPMI 1640稀释液（含HEPES），放入4℃备用。

2.消化终止后，迅速从水浴箱中取出加热弯管，关闭泵并停止振荡消化罐，调节泵速为300ml/min，开启蠕动泵，将冷稀释液导入罐内，开始收集消化产物至250ml离心管中。收集时应多人配合，离心管收集满后，立即盖紧盖子，4℃、280×g离心 1min。

3.离心结束后，在另一个BSC内，去上清，并保留少量的液体，小心重悬沉淀。合并4～5个离心管的沉淀至1个离心管中，重悬该沉淀，4℃、280×g离心洗涤1min。重复上述离心洗涤1次。

4.称量未被消化的胰腺重量并记录。

5.将所有组织收集在2个离心管中，用1ml移液管吸取100μl样本进行梯度离心前的细胞计数。

6.根据纯化操作步骤的不同，选择不同的试剂重悬组织：(1)若采用连续性梯度密度离心法进行纯化，则加入UWS重悬组织，使其终体积为100ml。(2)若采用不连续梯度密度离心法进行纯化，则加入100ml Eurocollins液重悬组织。

7.组织重悬后，将离心管放置于冰浴中静置30min。

五、胰岛的纯化

（一）连续性梯度密度离心法

1.检查COBE仪电源，检测仪器是否运转正常。将COBE袋小心装入COBE仪中，关上离心机玻璃盖及其附属设备。用止血钳在 “T”处附近夹住4路管子，留下1路管子保持开放。

2.在BSC内准备好梯度形成仪和磁力搅拌器，用连接管连接COBE袋和梯度形成仪，连接管通过蠕动泵并用止血钳夹住。

3.在梯度形成仪中加入150ml 1.100 Ficoll液，开启蠕动泵，将液体泵入COBE袋中，并排除COBE袋中的气体，关闭蠕动泵。

4.在梯度形成仪的两个杯子中分别加入120ml 1.100 Ficoll液和130ml 1.077的Ficoll液。

5.启动COBE仪，打开磁力搅拌器，调整好转速。启动蠕动泵，并同时打开夹子或开关，此时液体会被泵入COBE袋。

6.同时准备30～35个50ml离心管，分别编号，加入30ml洗液，备用。

7.待液体全部流完，立即加入已充分混悬的组织悬液，将组织液泵入COBE袋。

8.加载 20ml含酚红的 1×HBSS，吸入空气约1英寸后，再加载20ml 1×HBSS。

9.待液体全部泵入COBE袋，关闭蠕动泵，压 “SUPER OUT”键，离心半径9 cm，2400 r/min运转5min。

10.取下连接管，调整 “SUPER OUT VOLUME”为100ml/min，开始收集液体。

弃去最先收集的50ml液体，用已准备好的离心管连续收集液体，每瓶收集20ml液体，混匀，并在每管中取样，用双硫腙染液鉴定胰岛细胞的纯度。

11.420×g、4℃离心 1min，去上清。加入适量洗液重悬，280×g、4℃离心1min，去上清。重复离心洗涤1次。

12.将需保留的离心管合并，并取样计数。

13.取出COBE袋，在BSC内取样，经双硫腙染液染色后在显微镜下观察是否含有胰岛。若有较多数量的游离胰岛，用离心管收集沉淀，并用洗液洗涤2次，进行补救性纯化过程（见五（三）部分）。

（二）不连续梯度密度离心法

1.按上述操作准备好COBE仪和梯度形成仪，将静止已分层的胰岛组织液去上清，加入300ml Ficoll储存液（密度为1.132）重悬。

2.将组织悬液通过50ml注射器转移至1个600ml的转移袋中，用少量Ficoll储存液清洗离心管，封闭转移袋。

3.将转移袋挂在COBE仪上方的金属杆上，并和COBE袋连接，使组织流入COBE袋中。

4.同时准备4个装有125ml洗液的250ml离心管收集液体，并标记。

5.组织悬液完全进入COBE袋后，关闭夹子，打开和梯度形成仪相通硅管，将Eurocollins-Ficoll分离液（1.108）泵入连接管，关闭夹子。

6.打开和转移袋相通管子，完成排除COBE袋中空气操作。

7.调整速度为2000 r/min，离心半径9 cm，启动COBE仪平稳后，打开和梯度形成仪相连的硅管，启动蠕动泵，将密度为1.108、1.096、1.037的Eurocollins-Ficoll分离液各75ml，按顺序泵入COBE袋中。

8.待液体全部泵入COBE袋，关闭蠕动泵，压 “SUPER OUT”键。COBE仪运转3min。

9.离心结束后，小心取下连接管，调整“SUPER OUT VOLUME”为100ml/min，开始收集液体。收集好各部分后，关闭COBE仪。

10.各管取样计数，420×g、4℃离心 1min，去上清。加入适量洗液重悬组织，280×g、4℃离心1min，去上清。重复洗涤1次。

11.将需保留的离心管合并，并取样计数。

12.取出COBE袋，在生物安全柜内取样，经双硫腙染液染色后在显微镜下观察是否含有胰岛。若有较多数量的游离胰岛，用离心管收集沉淀，并用洗液洗涤2次，进行补救性纯化过程（见五（三）部分）。

（三）补救措施（不连续梯度密度离心法）

1.初次分离纯化（连续或不连续梯度密度离心法）后，应检查COBE袋沉淀中胰岛数量。若发现仍残留较多的胰岛，则应该采用补救性纯化方式避免胰岛的丢失。

2.合并所有的组织，洗涤沉淀3次（4℃、1000 r/min离心1min），去除残留的Ficoll液，沉淀加入300ml Eurocollins溶液重悬，置于4 ℃孵育45min，并按照不连续梯度密度离心法在COBE仪上再次重复纯化过程（见五（三）部分）。

3.完成补救性纯化过程后，用CMRL 1066培养液重悬最后的沉淀，混匀。取样进行胰岛计数。

六、胰岛计数和纯度评估

（一）胰岛计数

1.由于胰岛细胞团易发生沉淀，取样前必须彻底混悬胰岛，使取样具有代表性。

2.用移液管取样100μl，移入35 mm的细胞培养皿或24孔培养板中，加入双硫腙染液1min后，在带标尺的显微镜下观察并计数胰岛。

3.胰岛染色后呈红色，其它细胞不显色。直径≥50 μm的胰岛才列入计数范围，根据胰岛直径大小分类，计数每组胰岛的数量，并记录。

4.根据胰岛数量和稀释倍数，计算出实际的胰岛数（IPN）、胰岛当量（IEQ）。

（二）胰岛的纯度百分比和包裹胰岛细胞的百分比

1.显微镜下，通过估计呈红色的胰岛细胞数量和没有染上红色的腺泡细胞（棕色）数量，来评估胰岛细胞的纯度百分比。

2.根据胰岛细胞的纯度百分比计算胰岛的平均纯度，估算被腺泡细胞包裹的胰岛与游离胰岛的百分比。

七、胰岛培养

（一）培养瓶培养法

1.用0.5﹪HSA的CMRL 1066培养液重悬胰岛，分装各瓶，37℃、5﹪CO2条件培养。胰岛细胞在分配到培养瓶前取上清液进行无菌检测。

2.取培养过夜的胰岛样本进行细胞活力和葡萄糖刺激指数的检测（见八部分)。

3.胰岛接种密度为：20000 IEQ胰岛/175ml培养瓶，培养液30ml。培养前要仔细检查培养瓶是否有裂缝，培养结束后、移植前要检测胰岛是否被污染。胰岛在移植前24 h培养温度为37℃，然后移至22℃再培养24～48h。

（二）培养袋培养法：在胰岛加入培养袋（3 L）前，应先计算每袋胰岛的最大培养量。当胰岛纯度> 70﹪，按每个培养袋中最多加入200000 IEQ的胰岛计算；当胰岛纯度< 70﹪，按每个培养袋中最多可加入100000 IEQ的胰岛，培养液的终体积为550ml。标记好培养袋后，将胰岛细胞和培养液装入袋中，然后热封培养袋，去除所有管路。按上述温度要求进行培养。

八、胰岛素刺激指数检测

1.胰岛分离纯化后，根据胰岛计数结果用无菌技术吸取大约400个胰岛。

2.配制含有0.5﹪HSA的CMRL 1066培养基培养胰岛细胞。

3.在BSC内，将胰岛细胞移入一直径为100 mm的带盖细胞培养皿内，加入15ml培养基，正确标注并合上盖子，放入37℃、5﹪CO2培养箱内培养18～24 h。

4.准备葡萄糖刺激试验相关试剂：（1）25.0mmol/L葡萄糖溶液（高浓度）：在50ml的无糖RPMI 1640贮存液中，溶解0.439 g葡萄糖，再加入剩余的50ml贮存液，使葡萄糖的终浓度为25.0mmol/L，用1 N NaOH或HCl溶液调整pH值，0.22 μm过滤，标记后，置于4℃冰箱可保存10d。（2）2.8mmol/L葡萄糖溶液（低浓度）：0.250 g葡萄糖溶解于100ml无糖RPMI 1640贮存液中，再加入剩余的400ml贮存液，使葡萄糖的终浓度为2.8mmol/L，调节pH值，过滤，标记，放入2～8℃冰箱可保存10d。

5.胰岛细胞的静止培养和葡萄糖刺激：（1）预先在24孔细胞培养板的2个孔内分别滴入1200μl 2.8mmol/L的低浓度葡萄糖溶液，并标记 “L1”和“L2”；另2孔内分别滴入1200μl 25mmol/L的高浓度葡萄糖溶液，标记 “H1”和“H2”。（2）将培养板放入恒温培养箱，使培养板的温度达到37℃。（3）取2个带盖细胞培养皿，并注明 “1”和“2”，在每个培养皿内加入15ml低浓度葡萄糖溶液。（4）将过夜培养的250～400个胰岛细胞重悬于≤100μl的培养液，并转移至标注为 “1”的细胞培养皿内，轻轻混匀洗涤。（5）等稍微沉淀后，将“1”中的所有胰岛用≤100μl的液体，转移至标注为 “2”的细胞培养皿内，混悬，静止5min。

6.旋转 “2”细胞培养板以聚集胰岛细胞，用≤100μl的体积，将胰岛细胞转移至 “细胞”试管内。在试管内加入低浓度葡萄糖溶液，使体积达到试验所需的总体积。

7.在细胞培养板的 “L1”孔内加入300μl胰岛细胞悬液，使孔内溶液总体积达到1500μl。按上述操作将胰岛细胞加入各孔中。

8.盖上盖子，将细胞培养板放在37℃、5﹪CO2培养箱内培养2h。

9.培养结束后，取出细胞培养板，让胰岛细胞在室温下自然沉淀5min。

10.小心地从每个孔中吸取800μl上清液，并分别加入事先做好标记的试管内，置于冰浴上。

11.4℃、200～300 rpm离心试管3min，小心吸取700μl上清液，加入2ml冻存管内，用ELISA方法检测人胰岛素的含量。如果检测不能马上进行的话，应冷冻保存（-20℃或更低）。

12.将检测所得的高糖刺激孔的胰岛素含量除以低糖刺激孔，得到胰岛素刺激指数。

九、胰岛移植前制备

1.仔细核对胰腺供体与胰岛移植受者详细资料，包括姓名、年龄、性别、ABO血型、Rh血型、巨细胞病毒（CMV）检测结果、移植日期，核对受者体重（kg）、供受者HLA配型结果。

2.准备好移植前制备所需试剂和耗材，小心取出培养后的胰岛，在显微镜下观察每个培养瓶中有无污染，同时校验细菌、真菌、内毒素的检测报告。

3.在BSC内，分别集中所有的胰岛细胞至不同的250ml离心管中，并置于离心管架静止30min。小心取样上清液，送检分别进行细菌革兰染色镜检、细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测。

4.小心收集离心管内上清液，留少量上清，备用。将所有上清液都集中到另外的离心管中，并用移植培养液洗涤培养瓶，共3次（至所有胰岛被洗涤下来）。

5.将洗涤液和上述上清液合并，常温下280×g离心1min。吸取上清至另外离心管，并保留30～40ml溶液。将第2次上清再次离心，在新的上清取样，观察是否存在胰岛细胞。如果确认没有胰岛细胞的存在，就丢弃上清液。如果有，继续离心沉淀。

6.将所有沉淀混合在同一离心管中，常温下280×g离心 1min，弃上清。

7.准确定量总体积并用培养液重悬细胞，采样后进行胰岛细胞计数和纯度评估。

8.在准备好的胰岛移植袋上作好标注，并请第2人核实。

9.在150ml小袋内通过连接管加入50ml移植培养基，小心排出袋内全部气体。将准备好的胰岛制品通过注射器转入600ml转移袋内，并用20ml移植培养基冲洗涤离心管后，和肝素一并加入到600ml的转移袋内，排除气体后，用止血钳夹住耦合器。

10.将移植袋装入无菌方盘，放入运送箱后，送达移植手术室，移交给临床移植组人员并签字。