大鼠自体胸腺肾的功能研究

赵大强 陈立中 李军 邱江

胸腺是中枢性免疫器官，发挥对T淋巴细胞的选择发育功能。胚胎猪胸腺可以选择发育人造血干细胞，通过胸腺移植，可使供体的胸腺在受体体内选择发育受体T淋巴细胞从而诱导受体对供体特异性免疫耐受[1-2]。已有的研究表明胸腺对免疫耐受的形成是至关重要的[3-8]。在应用异体胸腺组织移植来诱导免疫耐受时，由于胸腺富含供体组织抗原，导致移植的胸腺受到强烈排斥而引起免疫耐受诱导失败，因此受体术前去胸腺是必要的。即便如此，胸腺组织移植仍不能诱导免疫耐受的稳定形成，但如果把胸腺作为一个带血管器官来移植则能更好地诱导免疫耐受的形成。为了达到这一目的，已有的研究尝试了两种非常有创意的途径，一是“胸腺肾（thymokidney，TK）”移植[9-11]，二是带血管的 “胸腺小叶”移植[12-15]，均取得了良好的效果。小型猪构建TK术后60d移植胸腺组织能恢复正常的结构，并支持胸腺细胞的发育[16]，但TK在移植之前其胸腺功能如何还没有报道。本研究尝试用大鼠建立了自体TK模型，并观察在进行TK移植之前移植胸腺的功能。

材料和方法

一、实验动物及麻醉方法

SD大鼠32只，雄性，由广东省医学实验动物中心提供。麻醉采用10﹪水合氯醛0.3ml/100 g腹腔注射。

二、手术设备

小动物呼吸机TKR-200C（江西特力麻醉呼吸设备有限公司）1台、氧气瓶、手术显微镜（SXP-1B，上海医用光学仪器厂），显微器械及普通手术器械，流式细胞仪等。

三、实验分组及手术方法

1.Ⅰ组：去胸腺组（12只，体质量150～250 g）。沿颈中线剪开皮肤及皮下组织，气管插管，小动物呼吸机连接氧气瓶支持大鼠呼吸。于胸骨柄中点剪开胸骨1.5～2 cm，暴露胸腺表面、胸膜和两侧肺上极，显微镜下直接撕破双侧胸膜上极，从底部翻起左右胸腺两叶，向上游离去除胸腺。仔细检查并摘除残留胸腺，止血完毕，前纵隔放置引流管关闭胸腔。脱机后吸尽气管渗液，缝合气管，缝合皮肤后负压吸引引流管片刻后拔掉引流管。2个月后随机选取5只长期存活大鼠加去脾脏手术作为第Ⅳ组。

2.Ⅱ组：TK组（15只，体质量150～250 g）。在Ⅰ组的手术基础上继续手术，摘除的胸腺放0～4℃生理盐水中保存。沿剑突到耻骨联合上取腹正中切口，暴露左肾，在左肾表面中下1/3处用显微无齿镊轻轻横行撕开约0.5 cm肾包膜，用镊子探进肾包膜下进行适当游离。把摘取的2胸腺两叶从正中分开，取一叶剪成3～4片，主要在于剪薄，分别轻轻放入肾包膜内，直到放满整个肾包膜。相同的方法行右侧肾包膜下自体胸腺移植，构建双侧自体TK。复位肠管，关闭腹腔。

3.Ⅲ组：假手术组（5只，体质量50～100 g）。模仿Ⅱ组进行开胸、开腹、气管插管通气手术，开胸见到胸腺后并不撕破胸膜去除胸腺，撕破肾包膜后不行胸腺移植。

四、检测、观察指标

1.术 后 0、1、2、3、4、6、8、12及 16周，3组动物分别抽取外周血，使用流式细胞仪检测外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞和CD4-CD8-T细胞所占的比例及变化情况。其中Ⅰ组在第8周时加去脾脏的5只大鼠加测10周时的流式检测。

2.Ⅱ组术后2周、4周、6周、8周、3个月、4个月分别处死大鼠1～2只，显微镜下观察双侧肾包膜下移植胸腺血管重建情况，留取标本，行组织形态学检查。

五、统计学分析

用SPSS 11.0统计软件对各组不同时间点的流式检测结果绘制均数线图。PBMC不同分化T淋巴细胞所占平均比例用表示，术后3个月时流式检测结果的组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

TK组术后2周已见到明显有血管自肾门生长入肾包膜下的胸腺组织中，扇形分布，左侧肾包膜下血供重建优于右侧，胸腺组织由移植时淤血颜色变成白色正常胸腺组织颜色，6～8周时移植胸腺组织增厚(图1)，组织学检查能见到正常胸腺组织结构（图2）。撕破的肾包膜在14 d时已完全重建。

肾包膜下移植的胸腺3～4个月后逐渐退化，表现为移植的胸腺组织中淋巴细胞减少，逐渐为脂肪细胞替代（图3）。

PBMC中不同分化T淋巴细胞的变化：（1）Ⅰ组和Ⅱ组术后6周内流式检测结果变化基本一致，6周后出现明显的分化，表现为Ⅰ组CD4-CD8-T淋巴细胞比例仍持续上升，在第8周Ⅳ组中升高得更明显，而Ⅱ组6周后开始逐渐下降（图4a，表1）。Ⅰ组成熟的单阳性（CD4+T和CD8+T）淋巴细胞在术后6周后继续下降，而Ⅱ组开始回升（图4b、4d；表 2、3）。Ⅰ组 CD4+CD8+T淋巴细胞在术后6周后仍有波动，后续的检测显示呈低水平，而Ⅱ组6周后较平稳（图4c，表4）；(2)Ⅲ组与实验组Ⅰ、Ⅱ在术后早期就呈现明显差异，但能看到术后1～3周内双阴性T淋巴细胞比例是下降的，成熟的单阳性细胞逐渐恢复正常，双阳性T淋巴细胞所占比例明显高于实验组（图 4） ；(3)去胸腺后 1～3周内，CD4+T 淋巴细胞先上升后回降，CD8+T淋巴细胞先下降后回升（图4b、4d）。术后12周，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组之间PBMC中CD4-CD8+T淋巴细胞的比例分别 为（56.4±5.2）﹪、（38.4±5.4）﹪、（60.7±7.7）﹪（F=46.486,P=0.000）；CD4+CD8-T 淋 巴细胞比例分别为（0.7±0.2）﹪、（1.1±0.2）﹪、（1.2±0.7）﹪（F=6.820,P=0.004）；CD4-CD8+T淋巴细胞比例分别为（17.8±5.1）﹪、（24.4±8.2）﹪、（10.3±3.7）﹪（F=9.069，P=0.001）.而其余时间各组间各类T淋巴细胞比例差异无统计学意义。

图1 胸腺肾移植组术后2周及8周大鼠左右胸腺肾情况，图a为术后2周大鼠左胸腺肾；图b为术后2周大鼠右胸腺肾；图c为术后8周大鼠左胸腺肾；图d为术后大鼠右胸腺肾

图2 胸腺肾移植组术后2周及8周胸腺肾组织学检查情况，图a为术后2周大鼠胸腺肾组织（HE染色×50）；图b为术后2周大鼠胸腺肾组织（HE染色×200）；图c为术后8周大鼠胸腺肾组织（HE染色×50倍）；图d为术后8周大鼠胸腺肾组织（HE染色×200）

图3 图a为术后16周大鼠胸腺肾（×10）；图b为术后16周大鼠胸腺肾组织（HE染色×50）；图c为术后16周大鼠胸腺肾组织（HE染色×200倍）；图d为术后16周大鼠胸腺肾组织（HE染色×400）

表1 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴细胞比例的变化（﹪，）

表1 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴细胞比例的变化（﹪，）

注：PBMC为外周血单核细胞

组别例数 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.1±7.047.3± 9.8 - 56.4±5.262.1±6.6Ⅱ 15 38.6±10.342.8±9.646.6±12.843.2±10.847.1±8.048.3±4.045.5±11.1 - 38.4±5.4 -Ⅲ 5 46.8± 8.748.6±8.338.0± 6.736.6± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.0±7.047.3± 9.854.0±5.360.7±7.7 -F值 0.808 1.041 0.549 2.970 0.010 0.925 0.118 46.486 P值 0.498 0.388 0.652 0.046 0.990 0.408 0.889 0.000

表2 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴细胞比例的变化（﹪，）

表2 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴细胞比例的变化（﹪，）

注：PBMC为外周血单核细胞

组别例数 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.5 - 25.1± 3.123.3±1.1Ⅱ 15 31.2±8.238.4±5.332.5± 7.428.7± 9.833.4±2.831.4±6.934.6±8.3 - 36.3±13.4 -Ⅲ 5 36.9±6.032.6±4.137.6±11.039.1±10.4 - - - - - -Ⅳ 5 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.530.0±1.528.0± 3.8 -F值 1.371 1.571 1.423 2.976 9.197 3.401 2.690 4.781 P值 0.269 0.215 0.254 0.046 0.001 0.047 0.085 0.016

表3 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴细胞比例的变化（﹪，）

表3 术后不同时间各组大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴细胞比例的变化（﹪，）

注：PBMC为外周血单核细胞，

组别例数 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.9 - 17.8±5.1 14.0±5.2Ⅱ 15 29.0± 8.617.1± 7.019.3±11.226.8±20.117.5± 7.519.4±8.818.9±8.0 - 24.4±8.2 -Ⅲ 5 14.7± 2.616.9± 4.422.7± 5.622.4± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.914.3±4.410.3±3.7 -F值 2.254 2.215 0.521 0.196 3.478 0.519 1.370 9.069 P值 0.100 0.105 0.671 0.898 0.044 0.601 0.270 0.001

表4 术后不同时间各组大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴细胞比例的变化（﹪，）

表4 术后不同时间各组大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴细胞比例的变化（﹪，）

注：PBMC为外周血单核细胞

组别例数 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 - 0.7±0.2 0.6±0.4Ⅱ 15 1.3±0.5 1.8±1.6 1.6±1.6 1.4±0.5 1.5±1.0 1.0±0.5 1.1±0.3 - 1.1±0.2 -Ⅲ 5 1.5±0.3 2.0±0.9 1.8±0.6 1.9±0.5 - - - - - -Ⅳ 5 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 1.5±0.9 1.2±0.7 -F值 1.273 1.411 0.722 0.619 1.353 2.536 0.106 6.820 P值 0.300 0.257 0.546 0.608 0.274 0.097 0.899 0.004

图4 图a为去胸腺组和胸腺肾组术后6周出现明显的分化，表现为去胸腺组CD4-CD8- T淋巴细胞比例仍持续上升，在第8周加去脾脏组中升高得更明显，而胸腺肾组6周后开始逐渐下降；图b,d为去胸腺组成熟的单阳性（CD4+ T和CD8+ T）淋巴细胞在术后6周后继续下降，而胸腺肾组开始回升；图c为去胸腺组CD4+CD8+ T淋巴细胞在术后6周后仍有波动，后续的检测显示呈低水平，而胸腺肾组6周后较平稳

讨 论

成功诱导特异性免疫耐受是解决器官移植免疫排斥的理想方法，近年来，胸腺移植对器官移植免疫耐受的诱导作用引起人们的重视，研究显示带血管的胸腺移植比胸腺细胞或胸腺组织块移植有更好的诱导免疫耐受作用，原因在于胸腺组织移植时在胸腺血供得到重建前有一个缺血期，导致移植胸腺损伤，还致敏了受体。而血管化的胸腺避免了这一时期，因此明显改善了诱导免疫耐受的效果。本文首次报道了用大鼠构建胸腺肾以使胸腺血管化，并在行胸腺肾移植以前对移植胸腺的功能做了评估。该模型在免疫耐受研究领域有以下优越性和应用前景：(1)大鼠肾移植模型已很成熟，应用广泛，一人操作，研究成本和要求比小型猪低；(2)已有的胸腺肾研究侧重于研究胸腺移植后诱导免疫耐受的效果，本模型在移植前进行胸腺功能评估，显示大鼠胸腺肾移植时间应选在胸腺肾构建后6周左右，不用像小型猪需等到术后2～3个月[7-9]，3～4个月后大鼠胸腺肾中的胸腺已开始退化；(3)评估胸腺功能的经典办法是选择在SCID小鼠或裸小鼠中进行胸腺移植[17]，本模型在去胸腺大鼠中进行胸腺功能评估，更能为下一步大鼠胸腺肾移植提供直接指导意义；(4)有学者报道了在大鼠体内行带血管的胸腺移植[18]，如果同时行其他器官移植，也达到了胸腺移植诱导免疫耐受时移植胸腺的同步血管化，但在大鼠这种小动物身上操作较难，要求高，不利于应用，本模型避免了这一缺点；(5)肾包膜局部血液供给丰富，手术操作简单，移植物的变化（增生、萎缩、吸收、退化或排斥）易于通过手术开腹直接观察，移植物也可便利地切取进行各种组织学检查。

本研究对照组术后早期双阳性T细胞在术后早期比例较高，考虑是由于正常功能的胸腺因为手术应激加强了对双阴性T淋巴细胞成熟发育的结果。去胸腺后3周内，CD4+T淋巴细胞先上升后回降，CD8+T淋巴细胞先下降后回升，这种变化考虑是由手术应激引起，是淋巴细胞对手术打击的一种正常反应。在Ⅰ组中第8周加去脾脏组中也发现8周后的一段时间内成熟的单阳性T淋巴细胞呈现类似变化也证实了这一点，只是这种反应没有第一次手术时反应明显，显示出成熟淋巴细胞在没有胸腺的情况下数量上仍然能对外界刺激作出一定反应，由此推测在没有胸腺支持新生T淋巴细胞发育的情况下，定居在其它淋巴组织中的成熟T淋巴细胞的增殖反应对PBMC中成熟T淋巴细胞数量的维持发挥了重要作用，在大鼠去胸腺后随访到16周也没见到单阳性T淋巴细胞下降到0，在加去脾脏后（脾脏是成熟T淋巴细胞定居的重要场所之一），双阴性细胞进一步上升，单阳性细胞继续下降也证实了这一点。在选取对照组时，大鼠年龄偏小（50～100 g），这样降低了和实验组的可比性，但从中也发现，未成年期大鼠（< 100 g）CD4+/CD8+比值大于成年大鼠（150～250 g），导致线图的起始值相差较远，有文献显示正常大鼠CD4+/CD8+比值约为4:1，测定的结果没有这么高，这可能与部分大鼠在胸腺肾构建完成关腹后取血有关，手术应激后导致CD8+T细胞升高。因为考虑到可比性降低，所以假手术组在4周后未再行流式检测。线图中Ⅰ、Ⅱ组在第10周的断点是由实验设计造成，该时间点未检测造成数值缺失。Ⅳ组加测第10周是为了更详细了解去脾脏的影响。去脾脏组证实了在阻断胸腺选择发育新生T淋巴细胞的情况下，外周成熟T细胞的扩增对PBMC中成熟T淋巴细胞数量的维持发挥了重要作用。

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