蒸发光散射-HPLC法测定硫酸妥布霉素注射液中的有关物质

朱晓璐，林昀，李霞（1.重庆大学生物工程学院，重庆400044；.重庆市药品检验所，重庆40111）

妥布霉素属氨基糖苷类抗菌药物，在紫外波段上只有末端吸收，2005年版《中国药典》[1]未对硫酸妥布霉素注射液中的有关物质进行控制；《美国药典（USP）》31版[2]上采用薄层色谱（TLC）方法进行有关物质控制，该方法经笔者进行一系列方法学验证，发现不能有效控制妥布霉素中的有关物质，而《英国药典（BP）》2008版[3]、《欧洲药典》6.0版[4]上均采用的电化学检测-高效液相色谱（HPLC）法，由于仪器昂贵，普及有一定难度。故笔者参考有关资料，采用蒸发光散射-HPLC法对硫酸妥布霉素注射液中的有关物质进行了探索性考察。

1 仪器与试药

LC-2010 A型HPLC仪（日本岛津公司）；ELSD2000型蒸发光散射检测器（美国Alltech科技公司）；Phenomenex Syregy C18色谱柱（250 mm×4.60 mm，5µm）、Phenomenex Gemini-NX C18色谱柱（250 mm×4.60 mm，5µm）、Phenomenex Luna C18色谱柱（250 mm×4.60 mm，5µm）。

三氟乙酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：F20071220）；妥布霉素对照品（批号：130527-200402，含量：91.4%）、卡那霉素B对照品（批号：130548-200501）、新霉胺对照品（批号：130411-200307）均来自中国食品药品检定研究院；暗霉胺由天津市药检所提供；硫酸妥布霉素注射液89批，分别来源于湖北天药药业股份有限公司等14家企业。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱；流动相：0.2 mol·L－1三氟乙酸溶液；流速：0.4 mL·min－1；蒸发光散射检测器；飘移管温度：110℃；载气流量：3.0 L·min－1。

2.2 杂质定位及辅料干扰考察

取妥布霉素已知杂质新霉胺、卡那霉素B、暗霉胺适量，按“2.1”项下的色谱条件进行杂质定位测定。结果，各杂质之间以及杂质与妥布霉素均能有效分离。另，由于硫酸妥布霉素注射液的处方相对单一，只有亚硫酸氢钠（或亚硫酸钠）、依地酸二钠和硫酸，故笔者对这几种辅料的干扰均进行了检测。各杂质及辅料出峰典型图谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 强制性破坏分离度考察试验

取样品适量，分别进行强制性热破坏（60℃下放置10 d，121℃下放置30 min）、光破坏（裸置于紫外光下48 h）以及氧化破坏（样品1 mL，加入30%双氧水1 mL，水1 mL，反应2 h后加水稀释至10 mL，供检测用），按照“2.1”项下的色谱条件进行考察。结果显示，妥布霉素与降解杂质能有效分离。

2.4 线性关系考察

取妥布霉素对照品0.01580 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作对照液5。再取上述溶液分别加水稀释制成14.44、28.88、46.21、101.09 μg·mL－1系列浓度的对照液1～4，将对照液1～5分别进样，记录峰面积。以相应的峰面积的常用对数值与对照液浓度的常用对数值分别作为横纵坐标，以最小二乘法计算回归方程得：lgA=1.2156 lgC+3.139（r＝0.9954，n＝5）。结果表明，妥布霉素检测浓度在0.14～1.01 μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 检出限考察

以妥布霉素计，本方法检测限为0.1072μg，定量限为0.2528μg，最小检出浓度为5.80μg·mL－1，最小检出限为0.14%。

2.6 对照溶液的选择

曾有研究资料[5]显示，不同pH的妥布霉素供试品溶液采用HPLC分析方法，用蒸发光散射检测器检测时，其响应值有较大差异，如：取硫酸妥布霉素，加水溶解并稀释制成每1 mL中含40µg妥布霉素的供试品溶液，其pH为5.08；而取妥布霉素标准品，制成相同浓度溶液时，其pH为8.70，进样后前者峰面积响应值为后者的2倍，为保证结果的正确性，其采用了供试品溶液稀释的自身对照法。为此，笔者也对pH的变化对响应值的影响进行了考察，结果见表1。

表1 pH值对妥布霉素响应值的影响Tab 1 Effects of pH value on tobramycin response value

上述结果表明，用蒸发光散射检测器检测时，当妥布霉素对照品与硫酸妥布霉素注射液样品均稀释制成相同浓度时，尽管两者pH相差较大，但峰的响应值并没有太大差异。结果表明，用蒸发光散射检测器检测时，供试品溶液pH对测定结果并无明显影响，故笔者选用了对照品对照法。

2.7 不同型号色谱柱对妥布霉素与卡那霉素B分离度影响的考察试验

根据各杂质以及辅料定位情况，卡那霉素B与妥布霉素相邻，为考察色谱柱填料对其分离度的影响，笔者采用不同填料的C18柱对妥布霉素与卡那霉素B的分离度进行了考察，结果见图2～图4。

结果显示，该色谱系统对柱子的选择性较大，同一品牌的C18柱由于其填料的细微差别，可引起其保留时间较大的变化，以致影响妥布霉素与卡那霉素B之间的分离度。

图2 Syregy C18Fig 2 Syregy C18

图3 Gemini-NX C18Fig 3 Gemini-NX C18

图4 Luna C18Fig 4 Luna C18

3 讨论

在该色谱条件下，硫酸根和亚硫酸根均在相对保留时间约0.46 min的位置出峰，钠离子在相对保留时间约0.52 min的位置出峰，依地酸根在主峰前位置出峰，与卡那霉素B杂质出峰位置重合，出峰时间相对保留时间约0.94 min，但依地酸二钠在按处方比例加入后稀释到测定溶液浓度（4 mg·mL－1）时，已检测不出乙二胺四乙酸（EDTA）主峰，故对杂质测定无影响。

强制性破坏试验结果显示，妥布霉素对热稳定性较好，其能够耐受115℃、30 min的灭菌温度，但121℃、30 min的过度灭菌方式杂质个数和杂质总量均明显增加，对暗霉胺影响不明显，但长时间的干热（60℃，10 d）会引起暗霉胺的增加；其对光敏感性不强，但易氧化。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：270.

[2]The United States Pharmacopoeia Convention.U.S.Pharmacopoeia/National Formulary[S].31.

[3]British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[S].2008.

[4]European Directorate for Quality Medicines.European Pharmacopoeia[S].6.0.

[5]天津市食品药品检验所.《中国药典》2010年版草案[Z].2010.