HPLC法测定金鸡片中原儿茶酸的含量

张火旺（河源市食品药品检验所，广东河源 517000）

金鸡片由金樱根、鸡血藤、千斤拔、穿心莲、功劳木、两面针等6味中药组成，具有清热解毒、健脾除湿、通络活血等作用，通常用于湿热下注引起的附件炎。金鸡片的现行标准[1]只收载了定性鉴别反应，有文献[2]报道采用HPLC法测其中功劳木的含量，但原儿茶酸含量测定未见文献报道。为进一步提高该药的质量标准，需建立金鸡片中鸡血藤的原儿茶酸含量测定方法。笔者参考文献[3]方法，采用高效液相色谱（HPLC）法测定金鸡片中原儿茶酸的含量，简便、准确，分离度好，可用于该产品的质量控制。

1 仪器与试药

LC-2010 AHT型HPLC仪、UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津公司）；AG-135电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-250 D超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

原儿茶酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110809-200604，含量：100%）；金鸡片（广东益和堂制药有限公司，批号：20100301、20100602、KC008，每片含干膏粉 0.247 g）；甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，色谱纯，批号：20100827282）；冰醋酸（广州化学试剂厂，分析纯，批号：20100301-1）；乙酸乙酯（广州化学试剂厂，分析纯，批号：20100703-2）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶Inertsil C18柱（250mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（v/v＝25∶75∶0.2）；检测波长：260nm；流速：0.8mL·min－1；进样量：10µL；柱温：30℃。采用峰面积外标法定量[4]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取原儿茶酸对照品10.50 mg，置于100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解至刻度，摇匀，作为原儿茶酸对照品贮备液（浓度为105µg·mL－1）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取金鸡片20片，除去包衣，精密称定，研细（过3号筛），精密称取0.6275 g，加0.1 mol·L－1的盐酸1 mL，再精密加入乙酸乙酯50 mL，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，滤过，精密量取续滤液25.0 mL，蒸干，残渣加50%甲醇适量超声5 min使溶解，转移至25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按其质量标准中处方比例同法制备不含鸡血藤的阴性样品，按“2.2.2”项下的制备方法处理得阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取对照品贮备液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测绘HPLC图谱，理论板数按原儿茶酸计算不低于5000，分离度为4.68，阴性对照液在组分的出峰时间区域无干扰峰。结果表明，处方中其他成分及辅料对供试品的测定无干扰作用。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取原儿茶酸对照品贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度并摇匀，配成原儿茶酸浓度为 1.050、2.100、3.150、4.200、5.250、6.300µg·mL－1的溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样10µL，测定峰面积。结果，以峰面积（Y）为纵坐标，以原儿茶酸进样量（X，µg）为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝4101676.19 X+2308.07（r＝0.9994，n＝6）。结果表明，原儿茶酸进样量在0.0105～0.0630µm范围内与峰面积积分值线性关系良好。

2.5 精密度试验

取同一对照品贮备液适量，连续重复进样6次，进样量10µL，测定峰面积。结果，RSD＝0.45%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号（批号：20100301）样品适量，共6份，照“2.2.2”项下方法处理并测定含量。结果，RSD＝1.02%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一样品溶液适量，于室温放置，每隔2 h测定1次，连续测定6次。结果，原儿茶酸含量的RSD＝0.81%（n＝6），表明样品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批号样品（批号：20100301，原儿茶酸含量：0.4480 mg·g－1，平均每片重：0.3136 g）适量，共6份，分别加入对照品贮备液（原儿茶酸：0.105 mg·mL－1）1 mL，按“2.2.2”项下方法处理，照“2.1”项下色谱条件进样各10µL，测定，计算原儿茶酸的加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批金鸡片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品贮备液（3.15µg·mL－1）和供试品溶液各10µL，注入HPLC仪，照“2.1”项下色谱条件测定，按外标法计算样品中原儿茶酸的含量，结果见表2。

3 讨论

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.1 检测波长的选择

取原儿茶酸对照品适量，用流动相为溶剂溶解，经紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描。结果发现，原儿茶酸在260 nm波长下有最大吸收，灵敏度高，故选择260 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

原儿茶酸属有机酸，极性较大，选择反相色谱法，流动相选择甲醇-水（v/v＝15∶85）的体系，出峰时间较长，且峰形较宽；选用甲醇-水（v/v＝25∶75）的体系，出峰时间适中，峰形仍较宽；选用甲醇-水-冰乙酸（v/v＝25∶75∶0.2）的体系，出峰时间约为9 min，峰形尖锐，理论板数达到5000以上，达到分离要求，故选择甲醇-水-冰乙酸（v/v＝25∶75∶0.2）为流动相。

3.3 提取方法的选择

采用50%、80%甲醇索氏提取4 h，50%、80%甲醇回流提取2 h，醋酸乙酯超声30 min，醋酸乙酯加水（1∶1）超声30 min，水提醇沉后乙酸乙酯萃取；发现水提醇沉后乙酸乙酯萃取的方法，含量较高且分离度也好，但是萃取过程中的重复性差，考虑到有机酸在酸性水中用乙酸乙酯萃取效果较好[5]，用少量0.1 mol·L－1盐酸加乙酸乙酯直接超声的方法，获得了含量较高且分离度也好的结果。

综上所述，本法专属性强，简便准确，精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率符合要求。几批次含量相差较大，这可能与原质量标准中对这种成分无含量控制有关，因此本法的建立有利于更好地控制该药品质。

[1]WS3-B-3432-98.1998.金鸡片标准[S].

[2]丘明明.HPLC法测定金鸡片中3种生物碱的含量[J].中国药物分析杂志，2011，31（5）：927.

[3]黄灿辉.HPLC法测定不同产地鸡血藤中原儿茶酸的含量[J].中医药导报，2009，15（3）：83.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录33.

[5]张春辉，吴爱英，杨晓云.壮腰健肾片的质量标准[J].中国药师，2006，9（12）：1121.